临床微生物学检验：实验5

临床微生物学检验

第五个实验周

目的要求1.掌握下呼吸道标本的分离培养及检测方法2.掌握的铜绿假单胞菌形态染色、培养特性、菌落特征和鉴定方法3.掌握流感、副流感嗜血杆菌形态染色、培养特性、菌落特征和鉴定方法

菌种试剂菌种：流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、金黄色葡菌球菌标本：模拟痰标本

主要试剂：X、V、X＋V因子纸片，氧化酶试剂，革兰染色液不发酵细菌微量生化编码管

第一天实验内容模拟痰标本①分离培养：接种（1个大血平/人+1个Mac/人+1个巧克力/人）②涂片干燥固定后革兰染色流感嗜血杆菌或副流感嗜血杆菌：①菌落观察、涂片干燥固定后革兰染色②卫星试验（1个小血平板/人）因子试验（MH平板1个/人）③转种巧克力平板（2个/组）

痰液及上呼吸道标本

肉眼观察培养前处理①直接涂片检查②

血平板、Mac

特殊细菌培养初报

巧克力平板

选择适当培养基和条件

菌落观察分离鉴定涂片纯培养

生化鉴定药敏

最终报告

②合格痰标本：白细胞＞25/低倍视野，鳞状上皮细胞＜10/低倍视野①洗痰、胰酶均质化嗜血杆菌属形态：G-b细小呈球杆状短丝状或多形态

培养：5-10%CO2

营养要求高生长需X或V因子

巧克力平板菌落:直径0.5-1.5mm、圆形、光滑、湿润、无色或灰白色半透明小菌落革兰阴性短小球杆菌（有多形性）副流感嗜血杆菌革兰染色结果培养基：巧克力平板血液中含有X、V因子，V因子处于抑制状态，加热80-90℃10-15min可破坏V因子的抑制物使V因子发挥作用。巧克力琼脂中加入抗生素可提高检出率

菌落特征:巧克力平板上无色或灰白色半透明小菌落卫星试验：金葡菌能合成释放V因子，在金葡菌菌落周围，流感嗜血杆菌菌落较大，远离则小因子试验：MH平板上贴上X、V、X＋V因子纸片，不同嗜血杆菌会在所需因子纸片周围生长副流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌卫星试验（血平板）金黄色葡萄球菌（划线或点种）

流感嗜血杆菌（密集涂布于平板上）卫星试验阳性结果

嗜血杆菌（密集涂布于平板上）X＋VVX因子试验（MH平板）操作方法、注意事项X＋V生长，V生长因子试验结果第一天实验内容模拟痰标本①分离培养：接种（1个大血平/人+1个Mac/人+1个巧克力/人）②涂片干燥固定革兰染色流感嗜血杆菌或副流感嗜血杆菌：①巧克力平板上菌落观察、涂片干燥固定革兰染色卫星试验（1个小血平板/人）因子试验（1个MH平板/人）③转种巧克力平板（2个/组）部分接种流感，部分接种副流感一个接种流感嗜血杆菌，一个接种副流感②金葡点种或划线第二天实验内容嗜血杆菌：①观察分区划线结果，观察菌落特点②卫星现象结果观察③因子试验结果观察痰标本：血平板菌落观察和革兰染色、氧化酶试验。麦康凯和巧克力平板上菌落观察。取Mac上浅粉红色的菌落接种相应的微量生化编码系统（非发酵菌微量生化编码系统）。

（上述实验每人均做）流感嗜血杆菌培养24h菌落菌落:直径0.5-1.5mm、圆形、光滑、湿润、无色或灰白色半透明小菌落流感嗜血杆菌培养48h菌落同学分离的流感嗜血杆菌菌落流感嗜血杆菌卫星试验阳性结果流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌卫星现象结果（二者卫星现象均阳性，上面“+”，下面“-”）溶血嗜血杆菌的卫星试验阳性流感嗜血杆菌卫星试验阳性某同学做的“卫星试验”副流感嗜血杆菌因子试验结果流感嗜血杆菌因子试验结果X+V因子周围生长流感嗜血杆菌因子试验结果X+V因子周围生长溶血嗜血杆菌因子试验结果

X因子V因子β溶血流感嗜血杆菌++-副流感嗜血杆菌-+-

X因子V因子β溶血

流感嗜血杆菌++-

溶血嗜血杆菌+++

副流感嗜血杆菌-+-

副嗜沫嗜血杆菌-+-

副溶血嗜血杆菌-++

杜克雷嗜血杆菌+--

嗜沫嗜血杆菌---

几种嗜血杆菌对生长因子需求痰培养平板上致病菌的初步判断原则：需要结合“痰标本涂片、培养及临床表现”才能判断培养出来的细菌是定植还是致病菌①患者的血象、体温、胸痛和肺部啰音等体现感染的临床表现。②痰涂片镜检见大量白细胞吞噬细菌③痰涂片见到的细菌培养大量生长（占所分出细菌的50%以上）绿色色素、金属光泽、特殊气味、β-溶血环血平板麦康凯平板巧克力平板巧克力平板：菌落圆形、大小不一、边缘不整、扁平、湿润、常呈融合态，特殊气味、色

素不易观察到。血平：类似巧克力琼脂上菌落，绿色色素、特殊气味，有金属光泽、有β溶血。

铜绿假单胞菌菌落形态革兰染色铜绿假单胞菌G-b、菌体长短不一、球杆状或长丝状

可疑菌落（痰培养中优势菌）涂片革兰染色革兰阴性杆菌氧化酶(+)

非发酵菌鉴定系统鉴定到种

非发酵菌微量生化鉴定系统第三天实验内容1.不发酵菌微量编码系统结果判断2.痰标本鉴定结果报告非发酵菌微量生化鉴定系统DNA酶试验

原理：甲基绿与长链DNA结合呈绿色，而短链的寡核苷酸不与甲基绿结合，呈灰白色。

精氨酸双水解酶试验（在非发酵菌鉴定中不加石蜡油）

原理：精氨酸经两次水解后,生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均为碱性物质，故可使培养基变碱，用指示剂指示出来。

乙酰胺利用试验

原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，使培养基变碱。

非发酵菌微量编码系统结果判断枸橼酸盐麦芽糖精氨酸甘露醇木糖乙酰胺DNA硝酸盐葡萄糖(厌氧)葡萄糖(需氧)氧化酶III