餐饮具的微生物检验技术

关于餐饮具的微生物检验技术第1页，共50页，2023年，2月20日，星期日

饮食业食饮具消毒是控制肠道传染病发生和流行的重要环节之一，现行有效的国家标准为GB14934-94食（饮）具消毒卫生标准。该标准适用于宾馆、饭店、餐厅、食堂等饮食企业的食（饮）具，也适用于个体摊点的食（饮）具。第2页，共50页，2023年，2月20日，星期日一、餐饮具消毒指标(感官指标、理化指标、细菌指标)1感官指标

1.1物理消毒（包括蒸汽、煮沸等热消毒）：食（饮）具必须表面光洁、无油渍、无水渍、无异味。

1.2化学消毒：食（饮）具表面必须无泡沫、无洗消剂的味道，无不溶性附着物。

第3页，共50页，2023年，2月20日，星期日2理化指标

采用化学消毒的食（饮）具，必须用洁净水清洗，消除残留的药物。用含氯洗消剂消毒的食（饮）具表面残留量，应符合表1的要求。

表1理化指标项

目指

标游离性余氯，mg/L<0.3烷基（苯）磺酸钠，mg/100cm2<0.1第4页，共50页，2023年，2月20日，星期日3细菌指标

采用物理或化学消毒的食（饮）具均必须达到表2的要求。（发酵法与纸片法任何一法的检验结果均可作为判定依据。）

表2细菌指标项

目指

标大肠菌群发酵法,个/100cm2<3纸片法,个/50cm2不得检出致病菌不得检出第5页，共50页，2023年，2月20日，星期日二采样与检验方法

1发酵法检测大肠菌群

1.1采样方法

食（饮）具抽检碗、盘、口杯，将2.0cm×2.5cm（5cm2

）灭菌滤纸片紧贴内面各10张（总面积50cm2、）、碟、匙、酒杯以每5件为1份，每件内面紧贴灭菌滤纸片各2张（总面积50cm2/份）,经1min，按序取置入50mL灭菌盐水试管中，充分振荡后，制成原液。

筷：取每双的下段12cm处约50cm2（l2cm×2cm×2cm），置入50mL灭菌盐水试管中，充分振荡20次，制成原液。

第6页，共50页，2023年，2月20日，星期日第7页，共50页，2023年，2月20日，星期日1.2操作步骤1.2.1初发酵试验选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL，36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。第8页，共50页，2023年，2月20日，星期日1.2.2复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

第9页，共50页，2023年，2月20日，星期日1.2.3大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按1.2.2确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见GB4789.3-2010附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。第10页，共50页，2023年，2月20日，星期日1.2.4MPN表(GB4789.3-2010附录B)表B大肠菌群最可能数.doc第11页，共50页，2023年，2月20日，星期日2纸片法检测大肠菌群

食（饮）具消毒采用专用的大肠菌群快速检验纸片。

2.1采样方法

随机抽取消毒后准备使用的各类食具（碗、盘、杯等），取样量可根据大、中、小不同饮食行业,每次采样6～10件,每件贴纸片两张,每张纸片面积25cm2（5cm×5cm）用无菌生理盐水湿润大肠菌群检测用纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于无菌塑料袋内。

筷子以5只为一件样品，用毛细吸管吸取无菌生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹拭纸片，每件样品抹拭两张，放入无菌塑料袋内。第12页，共50页，2023年，2月20日，星期日2.2检验方法

将已采样的纸片置37℃培养16～18h，若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。

第13页，共50页，2023年，2月20日，星期日

致病菌检验

GB4789.4-2010沙门氏菌检验.mht

GB4789.10-2010金黄色葡萄球菌检验.mht

GB/T4789.5-2003志贺氏菌检验.mht

GB/T4789.11-2003溶血性链球菌检验.mht3.1沙门氏菌检验第14页，共50页，2023年，2月20日，星期日沙门氏菌属简介

沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现3000多个血清型，我国已发现血清型近200个。形态特征：

革兰氏阴性，大小为1~3×0.4~0.9μm的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。第15页，共50页，2023年，2月20日，星期日伤寒沙门氏菌

沙门氏菌典型群落第16页，共50页，2023年，2月20日，星期日检样25g(ml)样品+225mlBPW1ml+TTB10ml1ml+SC10ml36℃±1℃，8h-18hBSXLD(或HE、显色培养基)挑取可疑菌落

42℃±1℃，18h~24h

36℃±1℃，18h~24h36℃±1℃，40h~48h36℃±1℃，18h~24h沙门氏菌检验程序第17页，共50页，2023年，2月20日，星期日生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+A1A2A3反应结果与左侧描述不符

甘露醇+、山梨醇+

ONPG-

沙门氏菌，血清学试验

非沙门氏菌

报告TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素（pH7.2），KCN第18页，共50页，2023年，2月20日，星期日3.2.2操作步骤

(1)前增菌

无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，于36℃±1℃培养8h～18h。

(2)增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。

(3)分离培养

分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。

第19页，共50页，2023年，2月20日，星期日表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。第20页，共50页，2023年，2月20日，星期日(4)生化试验

①接种三糖铁琼脂自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。

第21页，共50页，2023年，2月20日，星期日表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢

KA＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属KA＋（－）＋（－）－可疑沙门氏菌属AA＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属AA＋/－＋/－－非沙门氏菌KK＋/－＋/－＋/－非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性第22页，共50页，2023年，2月20日，星期日②其他生化试验:接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢

（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾

（KCN）赖氨酸脱羧酶A1＋－－－＋A2＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。第23页，共50页，2023年，2月20日，星期日③结果判定:

反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸

脱羧酶判定结果－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：＋表示阳性；＋表示阴性。

注：＋表示阳性；＋表示阴性第24页，共50页，2023年，2月20日，星期日反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

第25页，共50页，2023年，2月20日，星期日a）抗原的准备

一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1次～2次,自远端取菌培养后再检查。

(5)血清学鉴定

返回第26页，共50页，2023年，2月20日，星期日

b）多价菌体抗原（O）鉴定

在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。c）多价鞭毛抗原（H）鉴定同b）。返回第27页，共50页，2023年，2月20日，星期日3.2金黄色葡萄球菌检验3.2.1检验程序第28页，共50页，2023年，2月20日，星期日金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。第29页，共50页，2023年，2月20日，星期日3.2.2增菌和分离培养

(1)增菌:将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

(2)分离培养:将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养18h～24h或45h～48h。

(3)菌落特征:金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

第30页，共50页，2023年，2月20日，星期日3.2.3鉴定

(1)染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5m～1m。

(2)血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18h～24h。

取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2mL～0.3mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。

结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复试验。

第31页，共50页，2023年，2月20日，星期日3.3溶血性链球菌检验

3.3.1检验程序

第32页，共50页，2023年，2月20日，星期日3.3.2操作步骤(1)增菌培养

将样液吸取5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线接种子血平板。如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36℃士l℃培养24h，接种血平板。（2）形态与染色血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5mm～0.75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2mm～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。为革兰氏阳性球菌。第33页，共50页，2023年，2月20日，星期日（3）生化试验①链激酶试验：吸取草酸钾血浆0.2ml，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入18h～24h、36℃士1℃培养的链球菌培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25ml（如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3%～0.35%），振荡摇匀，置于36℃士1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动），然后观察凝固块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。第34页，共50页，2023年，2月20日，星期日②杆菌肽敏感试验挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36℃士1℃培养18h～24h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。第35页，共50页，2023年，2月20日，星期日3.4志贺氏菌检验GBT4789.5-2003食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验.pdf（1）增菌

吸取检样25mL，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，于36℃培养6~8h。

培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。（2）分离培养和初步生化试验

取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36℃培养18~24h。志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

第36页，共50页，2023年，2月20日，星期日HE平板照片发酵乳糖的某种肠杆菌不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌

不发酵乳糖，呈蓝绿色或蓝色,可能就是志贺氏菌第37页，共50页，2023年，2月20日，星期日沙门氏菌有黑色中心,如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。SS平板照片第38页，共50页，2023年，2月20日，星期日不发酵乳糖发酵乳糖麦康凯平板照片菌落为粉红色，半透明的，可能为志贺氏菌。第39页，共50页，2023年，2月20日，星期日EMB平板照片菌落为无色半透明状，可能为志贺氏菌。第40页，共50页，2023年，2月20日，星期日

挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18~24h，分别观察结果。

2－志贺氏菌3－沙门氏菌4－大肠杆菌志贺氏菌TSI斜面仍为红色；底层产酸不产气，变黄色；不产H2S，不出现黑色。第41页，共50页，2023年，2月20日，星期日下述培养物可以弃去：

a.在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；

b.在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；

c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；

d.产气的培养物；

e.有动力的培养物；

f.产生硫化氢的培养物。

凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做进一步的生化试验和血清学分型。第42页，共50页，2023年，2月20日，星期日(3)进一步的生化试验

葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶、pH7.2尿素、KCN生长、水杨苷和七叶苷的分解。

志贺氏菌属的培养物均为阴性结果(除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外)。葡萄糖铵:阳性者斜面上有正常大小的菌落,阴性者不生长或生长极微小的菌落。西蒙氏柠檬酸盐：阳性者斜面上菌落生长，培养基由绿色转为蓝色，阴性者不生长。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶：阳性者为紫色，阴性者为黄色。pH7.2尿素：阳性者为红色，阴性者为黄色。KCN：阳性者细菌生长，阴性者细菌不生长。水杨苷和七叶苷：阳性者产气。第43页，共50页，2023年，2月20日，星期日

生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。

已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵、甘露醇、棉子糖、甘油的发酵、靛基质试验。

志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。第44页，共50页，2023年，2月20日，星期日志贺氏菌四个群的生化特性生化群5%乳糖