分子生物学实验课件：实验一 分光光度技术及蛋白含量测定

实验一

分光光度技术及蛋白含量测定理论

掌握分光光度技术的基本原理了解分光光度计的基本构造实验

利用分光光度计进行蛋白质定量测定

1.双缩脲法测定蛋白质含量

2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量

3.紫外分光光度法测定蛋白质含量

本次实验内容分光光度技术（Spectrophotography）

一、基本定义

利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。

应用：定性、定量

优点：灵敏度高精确度高操作简便、快速

二、工作原理

1.物质对光线有选择性吸收作用。

2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。

3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质的浓度成正比。

分光光度法所使用的光谱范围：

200nm--10μm200-400nm400-760nm760-10000nm紫外光区可见光区红外光区

如何定性？

—

利用吸收光谱鉴定化合物利用分光光度计绘制吸收光谱曲线

用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，即吸收光谱曲线。每种物质有其特征性的吸收光谱

1.朗伯（Lambert）定律

一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。

I/I0=e-K1LI0:入射光强度；I

:透射光强度；L：介质厚度

如何定量？

—

Lambert-Beer定律2．比尔（Beer）定律一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。

I/I0=e-K2CI0:入射光强度；I

:透射光强度；C：介质浓度

3.Lambert-beer’slaw的合并一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。

I/I0=e-KclA=lgI/I0=Kcl

A：吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度

K：即摩尔消光系数，也叫摩尔吸光度，溶液浓度为

1mol/L,光程为1cm时的消光系数4.计算（1）标准管法（标准比较法）

实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。

A标准=K标准C标准L标准

A样品=K样品C样品L样品

A：吸光度；K

：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度

因标准液和样品液中溶质为同一物质，

K样品=K标准因盛标准液和测定液的比色杯径长相同

L样品=L标准故上二式可写成：

A标准/A样品=K标准C标准L标准

/K样品C样品L样品

C样品=A样品/A标准×C标准（2）标准曲线法

配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度，以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物的浓度。

标准曲线使用注意事项①标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。②吸光度在0.05-1.0范围内。③所作标准曲线仅供短期使用。④标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，避免误差产生。5．应用中注意的问题①Lambert-beer’slaw的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A宜在0.05～1.0之间，超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符②选择波长：最大吸收波长，理论----单一波长的光，实际-----波长范围较窄的光带③参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外所有的成分。

空白管：

测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。分光光度计一．基本部件

1．光源分光光度计上常用的光源有两种，即钨灯和氢灯

(或氘灯)。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨灯；在紫外光区，多使用氢灯。

2．单色器棱镜或光栅，把混合光分解为单一波长的光。

3．吸收池（比色皿、比色池）选用合适的比色皿（可见光—玻璃；紫外光–

石英；规格、新旧程度一致）

4．检测器

5．测量装置

二.分光光度计使用步骤（示教）三.注意事项

1.波长选择。

2.机器预热。

3.不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光电管疲劳。

4.不应把盛有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面。

5.比色皿使用注意事项1.由于330nm以下的光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石英比色皿。

2.同组使用的比色皿必须配套。

3.比色皿2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。

4.比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液体约占全部容积的2/3。

5.腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中。

6.每次使用后,应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色皿3～4次。本次试验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。光路蛋白质定量分析实验

实验一双缩脲法测定蛋白质含量

实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量

实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量

实验一双缩脲法测定蛋白质含量【基本原理】

蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲（H2NOC-NH-CONH2)结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。双缩脲法的灵敏度为1-20mg。试剂（ml）123456标准蛋白质溶液0.10.30.50.70.9—生理盐水0.90.70.50.30.11.0双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.0【操作步骤】（一）标准曲线的绘制1.取小试管6支，编号按下表操作2．混合后，于37℃水浴中放置15分钟，在520nm波长下比色，以

第6管调零，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵座标，蛋白质浓度的克数为横座标，绘成曲线。（二）样品测定：

取血清样品0.1ml，加生理盐水0.9m1，再加双缩脲试剂4m1，于37℃水浴中放置15分钟，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线并计算得出每l00ml血清（样品）中蛋白质的克数。

注意：双缩脲法的灵敏度为1-20mg，取蛋白标准液时注意浓度【基本原理】

考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成595nm，通过测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

优点：灵敏度高，1-5μg；测定速度快；干扰物质少。实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量1．取试管3支，编号按下表操作

试剂（ml）空白标准标本生理盐水0.1

蛋白标准液(50μg／ml)0.1

样品0.1

考马斯亮蓝试剂5.05.05.02.混匀，放置5分钟，在波长595nm处，以空白管调“0”，测定各管的吸光度。【操作步骤】3.计算

A标本/A标准

×50（µg/ml）

=样品中蛋白质的含量（µg/ml）

注意：蛋白标准液浓度50µg/ml实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量【基本原理】

由于蛋白质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm波长处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，可作定量测定。灵敏度：50-100μg【操作步骤】（一）制作标准曲线

1.取试管6支，编号，按下表操作。试剂（ml）123456

标准蛋白质溶液0.51.01.52.02.50

生理盐水3.53.02.52.01.54.0

混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调“0”

，在280nm波长下测定各管光密度，以各管的光密度值为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线图。（二）标本测定：取标本1.0ml，加入生理盐水3.0ml，测A280标准曲线上读出浓度。移液管在使用前的洗涤方法:

分别用洗涤液、自来水及去离子水洗涤外，也还需要用少量待量取的液体洗涤，可先慢慢地吸入少量洗涤的水或液体至移液管中，用食指按住管口，然后将移液管平持，松开食指，转动移液管，使洗涤的水或液体与管口以下的内壁充分接触。再将移液管持直，让洗涤水或液体流出。移液管在使用方法:

用移液管量取液体时，应把移液管的尖端插入液体中，但不能触底。用洗耳球将液体慢慢吸入管中，待溶液上升到标线以上约2cm处，立即用食指