实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶

亲和层析法纯化胰蛋白酶一．实验目的1.理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。二．实验原理亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。这种分子之间的结合能力做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”。在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（）,在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如）制成亲和吸附剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在2寸，又能被解离下来。采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到10-倍2以0上。三．实验方法步骤1.鸡卵粘蛋白的制备取蛋清，加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮：三氯乙酸：后，出现大量白色沉淀，搅匀后室温静置以上，待清蛋白完全沉淀，离心，弃去沉淀，上清液倒入锥形瓶并用塑料薄膜封好，置于

冰箱中冰浴片刻，缓慢加入倍体积的预冷丙酮，搅匀后冰浴直到出现沉淀,用真空泵抽去部分上清液，剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离心管中，以下离心，弃上清液。离心管底部沉淀物放置真空干燥器内，抽气去丙酮，然后用蒸馏水溶解。之后将鸡卵粘蛋白溶液装入透析袋内对蒸馏水透析。将透析液转移到离心管内，再次以下离心m2.鸡卵粘蛋白含量测定取上述离心液稀释倍，测，求其浓度，由于浓度值过大，再次稀释倍，测，得到最终的浓度。.胰蛋白酶的比活性测定在比色杯中加入底物溶液和在比色杯中加入底物溶液和|J的胰蛋白酶溶液，在人的条件下测定分钟内的，算出△的值。.鸡卵粘蛋白的抑制比活性测定以苯甲酰精氨酸乙酯为底物测定胰蛋白酶的活性。先在试管中加入缓冲液，胰蛋白酶溶液及鸡卵黏蛋白溶液，混合后在5水浴加热放置，使胰蛋白酶和鸡卵黏蛋白充分结合，然后取反应混合液2加到装有底物溶液的比色皿中，迅速测定其在波长的条件下，测定其在波长的条件下，载体的活化将适量的，用后移至小烧杯中，加253淋洗后用蒸馏水洗净，抽干N将装有的小烧杯放置在一个冰浴里振荡，用电动磁力搅拌器缓缓搅拌，反应器内的温度保持在℃左右。称取溴化氰放入一个烧杯中，加入乙肼使溴化氰完全溶解，取移液枪向装有凝胶的烧杯中滴加溴化氰，直到溴化氰加完后继续反应。停止反应，将凝胶迅速转到玻璃烧结漏斗内用抽滤，用蒸馏水洗涤后再用，缓冲液洗涤抽干后偶联。鸡卵粘蛋白与活化的载体偶联将已活化好的转移到三角瓶中。用，缓冲液将上述制备好的卵粘蛋白溶解，溶液全部转移到三角瓶中与活化好的偶联。在℃恒温摇床振荡小时左右。偶联终止后，将凝胶倒入玻璃烧结漏斗中抽干并用溶液洗去未偶联上的蛋白（收集滤液，测蛋白含量以计算偶联蛋白量）再用蒸馏水淋洗。接着用亲和洗脱液（甲酸一）淋洗。最后用蒸馏水洗至中性，浸泡于亲和柱平衡（2缓冲液）中，放冰箱待用。7亲.和层折纯化胰蛋白酶取层折柱一支，柱内装入1/体4积的亲和柱平衡液，亲和吸附剂一次装入柱内，自然沉降，调好流速，亲和柱平衡液洗至流出液在检测仪上绘出稳定基线，测定其值小于即可。将胰蛋白酶粗提液调至.过滤，取清液上柱吸附，亲和柱平衡液流至流出液在检测仪上绘出的曲线回归到原来基线水平，测定的值小于即可。用亲和柱洗脱液洗脱，收集胰蛋白酶峰，测胰酶的比活及含量。整个实验流程为：TOC\o"1-5"\h\z鸡蛋清S!!提取活化!!分离纯化!!!纯卵粘蛋白o-活化!偶联!--胰蛋白酶提取液!亲和层析!酶促动力学一纯胰蛋白酶f酶含量、活性测定四．实验结果

1.鸡卵黏蛋白浓度值将稀释倍测得代入公式：280nm鸡卵黏蛋白浓度（）A80nm*稀释倍数-，要获得的浓度值在0.413，则需要再稀释倍，测定，鸡卵黏蛋白浓度为胰酶比活性（）胰蛋白酶活性胰酶浓度*酶体积胰酶比活性（）胰蛋白酶活性胰酶浓度*酶体积52.50.27mg/ml*0.05ml*2.5.鸡卵黏蛋白抑制比活性值项目未加抑制剂的胰蛋白酶加入抑制剂的胰蛋白酶鸡）卵黏蛋白比活性（胰蛋白酶BAEE）△A.（未加入抑制剂的胰蛋白酶的）-AA.（加入抑制剂的胰蛋白酶的）"^nm/m"0.001*抑制剂的浓度*抑制剂的体积

(0.232-0.022)*2.5/4—0.043-(-0.117)/4=70.001*0.242*0.05-.偶联蛋白量淋洗液滤液体积溶液淋洗亲和洗脱液亲和柱平衡液偶联蛋白含量酶.蛋白含量、比活性测定(1)亲和层析分离胰蛋白酶层析图内测得的值测定3-9O0.30.20.30.2200300测定的酶蛋白7则浓度280酶蛋白含量胰蛋白比活性()p五．数据分析与讨论(1)鸡卵黏蛋白的浓度约为14.02mg/ml,选用的是稀释6倍得出值，这与稀释60倍反推浓度值是不一样的，存在着实验误差。在测定鸡卵黏蛋白抑制比活性值时，加入抑制剂得到的值随时间变化曲线性不好，在有一个很大的波动，同时在的时刻，从曲线中看不出反应是否结束，所以我觉得应该舍弃之前的数据，将时间控制在范围内得到的才能更好的反应它的鸡卵黏蛋白抑制比活性值。通过观察未加抑制剂的胰蛋白酶与加抑制剂的胰蛋白酶的值曲线，可以看出两条曲线斜率相近，表现出抑制效率在该时间段内是相等的。(2)在鸡卵粘蛋白与活化的载体偶联终止淋洗阶段，洗脱液洗脱之后的滤液测定的值为，说明洗脱效果显著。得到的偶联蛋白含量为，偶联率为，偶联效果还不错。(3)亲和层析分离胰蛋白酶层析图中出现了两组峰值，第一是杂蛋白的洗脱峰，而需要测定胰蛋白需要收集的是第二个洗脱峰。层析效果较好，则收集到的蛋白纯而含杂质较少。测定胰蛋白比活性的值随时间变化曲线性较好，说明加的酶(10pL)和抑制剂(2.99ml)的用量合适。我们组刚开始加的酶量为15PL,反应很快达到平衡，曲线斜率高。通过这个变化可知，在测定胰蛋白酶活性及抑制剂抑制活性时，应注意酶和抑制剂的用量，若酶用量较大，则反应很快达到平衡，动力学曲线斜率高；反之，若用量小，则反应缓慢，达到平衡所需时间较长，动力学曲线斜率低。同理，抑制剂用量过大，则很快抑制了酶的活性；反之，则酶活性下降很少，动力学曲线会产生较大的偏差。通过实验数据可知亲和层析法得到的纯胰蛋白酶比活可达1.118*104BAEE单位/mg,纯化效率为10倍以上，获得的胰蛋白酶纯度高。(4)pH值及温度的调控在本实验中至关重要，因为鸡卵黏蛋白和胰蛋白酶都是蛋白质分子，对pH值和温度都有相应的耐受区间。比如胰蛋白酶应保存在4c冰箱中，用时迅速