仪器分析课件高效液相色谱法详解

仪器分析课件高效液相色谱法详解演示文稿当前1页，总共71页。（优选）仪器分析课件高效液相色谱法当前2页，总共71页。16-1概述

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。当前3页，总共71页。16-1-1高效液相色谱法

在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典色谱有较高的效率和实现自动化操作。

经典液相色谱：流动相常压输送，所用固定相柱效低，分析周期长。

现代液相色谱：高压输送，柱效大大提高，同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续监测。高效液相色谱法具有分析速度快，分离效能高，实现了自动化等特点。又称为现代液相色谱法、高压液相色谱法或高速液相色谱法。当前4页，总共71页。

和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相---固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。16-1-2液相色谱分离原理及分类当前5页，总共71页。

被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。

色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。当前6页，总共71页。

根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。当前7页，总共71页。

它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：当前8页，总共71页。

高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达103cm·min-1。高效液相色谱法与经典液相色谱法：当前9页，总共71页。

例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。当前10页，总共71页。

（l）两者应用范围不同。气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。

高效液相色谱法与气相色谱法：当前11页，总共71页。（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为：

①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。当前12页，总共71页。

②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。③液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。当前13页，总共71页。

（3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。当前14页，总共71页。

综上所述，高效液相色谱法具有高柱效，高选择性，分析速度快，灵敏度高，重复性好和应用范围广等优点。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。当前15页，总共71页。16-2高效液相色谱仪当前16页，总共71页。当前17页，总共71页。当前18页，总共71页。当前19页，总共71页。当前20页，总共71页。

高效液相色谱仪的结构示意见图16-2，一般可分为5个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统，检测系统和记录系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。当前21页，总共71页。16-2-1高压输液系统（1）溶剂贮存器（2）高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。当前22页，总共71页。（3）梯度洗脱装置梯度洗脱就是在分离过程中使用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH或离子强度相应的变化，以达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。当前23页，总共71页。外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:

一台高压泵,通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。当前24页，总共71页。梯度洗脱的实质是通过不断的变化流动相的强度，来调整混合试样中各组分的k’值，使所有谱带都以最佳平均k’值通过色谱柱。它在液相色谱分离中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k’值的变化是通过改变溶剂的极性、pH和离子强度来实现的，而不是借助改变温度来实现的。当前25页，总共71页。16-2-2进样系统

通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：当前26页，总共71页。16-2-3

分离系统

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。当前27页，总共71页。16-2-4液相色谱检测器

作用---用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。表16-1当前28页，总共71页。16-3液固色谱法

液-固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附能力的差异来进行分离的，也称液固吸附色谱。当前29页，总共71页。16-3-1吸附机理

当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留（就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分子）于是，在固定相表面发生竞争吸附:

Xm+nSad==Xad+nSm

Xm和Xad分别表示在溶剂中和被吸附的溶质分子，Sad和Sm表示被吸附剂所吸附和在流动相中游离的溶剂分子，n表示吸附X分子所需要解吸的S分子数目。当前30页，总共71页。当吸附剂对溶质分子的吸附能力大于对溶剂分子的吸附能力时，溶质分子就吸附在吸附剂上，而将溶剂分子脱附；反之，溶质分子脱附。显然，溶质分子的吸附能愈大，则保留值愈大；反之，保留值小或不被保留。当前31页，总共71页。吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和物理化学性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂性质近似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性，不能用该法分离相对分子质量不同的同系物。当前32页，总共71页。16-3-2液固色谱固定相固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的就是活性炭。极性吸附剂又分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧酸和吡咯衍生物。最常用的是硅胶，其次是氧化铝。很多薄层色谱和经典色谱是用硅胶进行分离的。现代液相色谱中硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。表16-2。当前33页，总共71页。16-3-3液固色谱流动相液相色谱的流动相必须符合下列条件：（1）能溶解试样，但不能与试样发生反应；（2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应；（3）黏度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效；（4）应与所用检测器相匹配，例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光；（5）容易精制、纯化，毒性小，不易着火，价格尽量便宜等。当前34页，总共71页。选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果试样组分的分配比值范围很广，则采用梯度洗脱。当前35页，总共71页。16-3-4应用

液固色谱最适宜分离那些溶解在非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。特别适用于分离异构体。当前36页，总共71页。16-4液液色谱法16-4-1分离原理

液液色谱又称液液分配色谱，分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。分配系数小的组分，保留值小，先流出柱。与气相色谱不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。当前37页，总共71页。16-4-2固定相液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类。（1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）

30～40µm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2µm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；（2）全多孔型载体由硅胶、硅藻土等材料制成，直径为30-50µm的多孔型颗粒（3）全多孔型粒子载体由nm级的硅胶粒子堆积而成，又称堆积硅珠，载体粒度为5-10µm，由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。当前38页，总共71页。

由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液β，β′-氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。当前39页，总共71页。

为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。当前40页，总共71页。16-4-3流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。当前41页，总共71页。

如果采用极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相（流动相的极性小于固定相的极性），称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用非极性物质为固定相，极性溶剂为流动相（流动相的极性大于固定相的极性），称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，例如适于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物，其流出顺序与正相色谱恰好相反。

当前42页，总共71页。16-5化学键合相色谱法采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。它是由液相色谱发展起来的，但因分离机制和固定相特性方面都与液液色谱涂层有差别，另外也因化学键合相色谱在现代液相色谱中占有重要地位，所以一般不宜将化学键合相色谱称为液液色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。当前43页，总共71页。根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。在极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小一些，所以极性键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱，也可作为反相色谱。但通常所说的反相色谱系指非极性键合相色谱。当前44页，总共71页。16-5-1化学键合固定相法化学键合固定相一般采用硅胶（薄壳型或全多空微粒型）为基体，在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为下列四种键型：当前45页，总共71页。（l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相

它是最先用于液相色谱的键合固定相。用醇与硅羟基发生酯化反应：

≡Si－OH＋ROH→≡Si－OR＋H2O

由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性，但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。一般用极性小的溶剂，分离极性化合物。当前46页，总共71页。（2）≡Si－C或Si-N共价键合固定相共价键键合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在4～8范围内。当前47页，总共71页。（3）硅烷化（≡Si-O-Si-C）键合固定相

这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70℃以下，pH=2～9范围内正常工作，是目前应用最广泛的键合相。当前48页，总共71页。16-5-2反相键合相色谱法此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37、硅胶-苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛-水、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；当前49页，总共71页。关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶剂作用理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时：当前50页，总共71页。

一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。当前51页，总共71页。当前52页，总共71页。反相色谱应用非常广泛，自1976年以来，高效液相色谱分离任务的60%-80%是用反相来完成的。反相色谱具有通用型液相色谱的特点。常规反相色谱技术，不仅可以分离不同类型的化合物，尤其适于分离同系物，非极性及极性较弱的化合物，例如多环芳烃等低极性化合物。控制离子化技术，用流动相加入缓冲溶液或改变pH的方法，分离不离子化或弱离子化的体系。当前53页，总共71页。16-5-3正相键合相色谱法此法是以极性的有机基团，CN、NH2、双羟基等键合在硅胶表面，作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离极性化合物。当前54页，总共71页。

此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。当前55页，总共71页。16-5-4离子性键合相色谱法当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如-SO3H，-CH2NH2、－COOH、-CH2N（CH3）等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。当前56页，总共71页。化学键合相色谱的优点：适用于分离所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成和种类来有效的分离非极性、极性和离子型化合物。由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。当前57页，总共71页。键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。这类固定相柱效高，使用周期长，分析重现性好。当前58页，总共71页。当前59页，总共71页。16-6离子交换色谱法（IEC）

离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。

其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。16-6-1分离原理当前60页，总共71页。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+

阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH-

平衡常数K值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中解离后，对离子交换中心具有不同的亲和力，因此，具有不同的平衡常数。亲和力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。当前61页，总共71页。16-6-2固定相常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种型式，一是常见的纯离子交换树脂；二是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂，具有很高的柱效，但柱容量不大；三是大孔径网络树脂，适用于非水溶液中物质的分离，因为它们的孔径和内表面积大，不需要溶胀，便可满意地使用。当前62页，总共71页。按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂具有与试样中阳离子交换的基团，又可分为强酸性和弱酸性树脂。阴离子交换树脂具有与试样中阴离子可交换的基团，又可分为强碱性和弱碱性。表16-6.当前63页，总共71页。16-6-3流动相最常用的是水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提供特殊的选择性，并改善试样的溶解度。所用的缓冲溶液，通常由下列化合物配制：钠、钾、铵的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其相应的酸混合成酸性缓冲溶液或氢氧化钠混合成碱性缓冲溶液等。当前64页，总共71页。16-6-4应用主要是用来分离离子或可解离的化合物。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例