三基因工程常用受体细胞

第二节、宿主细胞分类及特点分类：原核细胞（大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等）真核细胞（酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞）第2页/共57页一、原核表达系统的特点（一）优点：1、结构简单，基因组成及功能相对清楚，易于遗传操作及转化2、生理代谢途径及表达调控机制相对清楚，便于表达调控3、生长迅速，要求条件低（大肠杆菌倍增时间为17分钟），易于大规模培养。第3页/共57页（二）缺点1、不能识别剪切内含子，不能表达基因组DNA，只能表达cDNA；2、缺乏真核生物的蛋白质加工修饰系统，不能进行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、酰胺化等修饰作用；

蛋白酶解作用：从蛋白前体中切去一段氨基酸序列，从而获得功能性分子

糖基化意义：赋予蛋白独特的结合性并增强稳定性3、不具备真核生物的蛋白质复性系统（如蛋白二硫键异构酶），不能进行真核蛋白的正确折叠；第4页/共57页二、酵母（yeast）表达体系特点酵母菌是最简单的真核单细胞生物；是外源真核基因最理想的表达体系。

第5页/共57页（一）优点：

1、全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便

2、具有原核生物无法比拟的蛋白翻译后加工修饰系统。对表达的蛋白可进行正确折叠和糖基化、磷酸化等修饰；

3、安全：不含特异病毒、不产生毒素，美国FDA认定为安全的

4、繁殖迅速（倍增期约2小时），要求条件低，大规模发酵工艺简单，成本低廉；

5、能外分泌第6页/共57页（二）缺点：1、生长相对细菌缓慢2、对有些生物活性蛋白仍无法表达或正确修饰，比如蛋白超糖基化第7页/共57页超糖基化修饰作用酵母菌糖蛋白的N－糖基外链的组成成分只有甘露糖，但其分支结构极为复杂的的现象称为超糖基化修饰作用。

酵母菌高等真核生物O－寡聚多糖链甘露糖单体唾液酸基团N－糖基外侧链甘露糖甘露糖

N－乙酰葡萄糖胺半乳糖果糖唾液酸等第8页/共57页N-连接糖基化(N-linkedglycosylation)

新合成蛋白进行糖基化修饰的一种方式。糖通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH2基连接，所以将这种糖基化称为N-连接的糖基化。第9页/共57页O-连接的糖基化（O-linkedglycosylation）高尔基体中进行的另一种蛋白质的糖基化，将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基的氧原子上。第10页/共57页三、哺乳动物细胞表达特点是表达哺乳动物基因（如人基因）的最好受体细胞。优点：1、能识别和剪切内含子并加工为成熟的mRNA，既可表达cDNA又可表达基因组DNA；2、表达产物具有正确地高级结构和糖基化、磷酸化等修饰。3、表达产物可分泌到培养液中，纯化容易。第11页/共57页缺点：1、细胞生长慢，培养条件刻苛，大规模培养工艺复杂、费用高2、培养液中产物浓度较小3、转化细胞筛选麻烦第12页/共57页

主要基因工程表达体系比较表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌第13页/共57页第三节、常用原核表达细胞大肠杆菌枯草芽孢杆菌短小芽孢杆菌第14页/共57页一、大肠杆菌表达体系（一）生物学特性革兰氏阴性杆菌大小2～4um×0.4～0.1um；无芽孢；一般无荚膜(capsule)裂殖(Fission)分裂，37℃17分钟繁殖一代。第15页/共57页（二）特点优点：1、载体受体系统完备2、外源基因表达水平高，可达总蛋白5％～30％；3、下游技术成熟第16页/共57页缺点：1、胞内表达蛋白易形成无活性的包涵体，需进行复性操作；可溶性表达的胞内真核蛋白易被细菌蛋白酶水解2、蛋白分泌机制不健全，外源真核基因很难实现分泌表达，且分泌产物大多只能分泌到细胞周质（细胞质与外膜之见的间隙）；少数分泌表达的蛋白表达效率比包含体形式低很多。3、胞内表达产物蛋白质N端多余一个甲硫氨酸残基（由起始密码ATG编码），影响活性或容易引起免疫反应

4、细胞壁含脂多糖（内毒素），增加了分离纯化难度第17页/共57页包涵体细胞内由生物大分子致密聚集形成的被膜包裹或无膜的水不溶颗粒状物（相差显微镜或电子显微镜下可见）。组成：1、外源重组蛋白：50％以上2、宿主蛋白：RNA聚合酶、核糖核蛋白体、外膜蛋白等3、质粒编码蛋白：如标记基因产物4、非蛋白分子：DNA、RNA、脂多糖等蛋白特点：氨基酸序列组成正确，空间构象往往错误第18页/共57页（三）在基因工程中的应用扩增外源DNA（双链、单链）构建基因文库（DNA文库、cDNA文库）高效表达原核生物基因表达不需翻译后加工、修饰的真核蛋白第19页/共57页五、实验室常用的大肠杆菌

用于接受质粒：C600W3110HB101JM83

JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654

第20页/共57页二、芽孢杆菌（Bacillussubtilis）表达体系（一）生物学特性革兰氏阳性杆菌大小0.7～0.8×2～3m能产生芽孢；第21页/共57页（二）特点优点：1、具有高效分泌机制，可将表达的外源蛋白高效分泌到培养基中，且多数真核蛋白经芽孢杆菌分泌后便具有天然构象和生物活性2、胞壁不含脂多糖，不产生内毒素第22页/共57页缺点1、载体受体系统不完备2、常规方法不易转化3、野生型芽孢杆菌合成和分泌大量的胞外蛋白酶，直接影响表达产物的稳定性4、发酵技术不如大肠杆菌成熟第23页/共57页（三）基因制药目前普遍使用的芽孢菌表达系统及载体枯草芽孢杆菌：蛋白分泌能力强，但同时至少分泌6种蛋白酶短小芽孢杆菌：蛋白分泌能力与枯草芽孢杆菌接近，但胞外蛋白酶活性远低于枯草芽孢杆菌，且可分泌蛋白酶抑制剂第24页/共57页多重蛋白酶基因缺陷枯草芽孢杆菌受体菌DB428﹥WB500﹥WB600DB428、WB500、WB600蛋白酶活性分别只及野生型的3.1％、0.8％、0.3％，若加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）则WB600胞外检测不到蛋白酶活性。第25页/共57页两株胞外蛋白分泌水平较高的短小芽孢杆菌野生株芽孢杆菌47株HPD31株在合适培养条件下，每升培养液可积累30g蛋白产物第26页/共57页芽孢杆菌使用的表达载体pNU210PYQLpUB18第27页/共57页（四）在基因工程制药中的应用重组蛋白多肽药物的分泌表达白细胞介素－2白细胞介素－3表皮生长因子（EGF）人－干扰素乙肝病毒核心抗原第28页/共57页第四节、基因制药常用酵母表达细胞酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)）乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）多型汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）

第29页/共57页一、酿酒酵母是第一个用于基因药物表达的酵母菌，遗传背景已相当清楚：有17条染色体，1996年完成其全基因组测序，基因组为12068kb，阅读开放开架5887个，编码约6000个基因，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。受体细胞举例：酿酒酵母GRF18第30页/共57页应用1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。

FDA批准的第一个基因工程疫苗就是酿酒酵母表达的乙肝疫苗（Merck公司）上市产品还有人胰岛素（丹麦Novo－Nordisk公司）和人粒细胞集落刺激因子（Immunex公司）等第31页/共57页存在问题1、外源基因表达水平不高。原因：（1）密码子使用的偏向性（tRNA与外源基因密码子不匹配）（2）乙醇发酵途径活跃导致生物大分子合成普遍受到抑制（3）质粒的不稳定性2、重组异源蛋白超糖基化修饰第32页/共57页二、巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是近年来发展最为迅速，应用最为广泛的酵母细胞。是一种甲基营养菌，能在相对较为廉价的甲醇培养基中生长。第33页/共57页优点

除具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点：1、具有目前最强，调控机理最严格的启动子之一－乙醇氧化酶AOX1基因启动子,外源蛋白表达量高（一般500-4000mg/L，最高为破伤风毒素C达到12g/l）。2、表达质粒能在基因组的特定位点稳定整合。3、蛋白产物糖基化修饰作用大多数情况下接近哺乳动物细胞且可直接以天然可溶形式分泌到胞外。第34页/共57页缺点发酵周期长，要添加甲醇分子生物学基础不清楚，遗传改造难度大。第35页/共57页应用

生产重组真核药物蛋白：近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。药物蛋白已有20多种，见李元《基因工程药物》P52表。如人IL－2、人血清白蛋白、TNF、HBsAg、EGF、破伤风毒素C片断、人巨细胞病毒抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物等，有些即将进入市场。第36页/共57页常用毕氏酵母菌

KM71和GS115:都具有HIS4营养缺陷标记。

GS115茵株：具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；

KM71菌株：AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型共同特点:为组氨醇脱氢酶缺陷株，与带有his标记基因的表达质粒配合使用第37页/共57页三、乳酸克鲁维酵母具有可稳定存在的附加体型质粒pKD1载体及高拷贝整合型质粒pMIRK1外源基因表达水平比酿酒酵母高，如由重组乳酸克鲁维酵母合成的人IL－1β是重组酿酒酵母的80－100倍。第38页/共57页四、多型汉逊酵母表达系统蛋白糖基化修饰作用接近哺乳动物细胞。也是一种甲基营养菌。第39页/共57页举例：利用重组酵母生产乙肝疫苗第一代乙肝疫苗：病毒携带者体内提取存在问题：1、来源有限2、提取过程复杂3、致病潜在危险4、成本高第40页/共57页第二代乙肝疫苗－重组乙肝疫苗第一阶段：大肠杆菌重组乙肝疫苗。20世纪70年代末尝试用大肠杆菌表达乙肝表面抗原HBsAg，但表达水平极低第二阶段：酿酒酵母重组乙肝疫苗。起始于20世纪80年代初，将HBsHg（或s多肽）的编码序列置于ADH1（酿酒酵母的乙醇脱氢酶1基因）启动子或PGK（磷酸甘油酯激酶基因）启动子后面，表达出具有免疫活性的非糖基化HBsHg。目前已作为乙肝疫苗商品化，商品名为Recombivax－B或Engerix－B。第41页/共57页第三阶段：巴斯德毕赤酵母重组乙肝疫苗HBsAg基因稳定整合在巴斯德毕赤酵母染色体上表达产物量比在酿酒酵母中高1倍，并且表达蛋白效价高出酿酒酵母数十倍。第42页/共57页第五节、常用哺乳动物表达细胞能在培养基中无限生长的哺乳动物细胞系。一般为与正常细胞生理特性基本接近、无平面接触抑制特性的肿瘤细胞系或异倍体连续细胞系第43页/共57页有限细胞系和无限细胞系有限细胞系（finitecellline）：正常细胞经过多次传代后，一般可连续培养30～50代，就会逐渐失去增殖能力，也就是说它们只能生长有限的时间，经过若干传代培养后将老化死亡，把这类细胞称为有限细胞系。无限细胞系（infinitecellline）或连续细胞系（continuouscellline）：当细胞经过自然或人为的因素转化为异倍体后，能变为无限细胞系，没有分裂次数的限制。第44页/共57页药物生产应用的主要细胞系非洲绿猴肾细胞（COS）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、小仓鼠肾细胞（BHK）、人胚胎肾细胞（HEK－239）、C127用于基因瞬时表达：COS、BHK、HEK－239用于基因稳定表达：CHO第45页/共57页一、CHO细胞（Chinesehamsterovarycells）（一）一般特性：分离自中国仓鼠卵巢（Chinesehamsterovary，CHO）上皮样细胞，贴壁生长型对水泡性口炎和Getah病毒敏感。第46页/共57页细胞贴壁培养和悬浮培养

第47页/共57页（二）优点

1、外源基因整合到宿主细胞后能稳定保持；2、可分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。3、蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。4、培养条件要求低。对剪切力和渗透压有较高的忍受能力；能在无血清的条件生长。第48页/共57页（三）应用有多个衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯氨酸。采用二氢叶酸还原酶（DHFR）的缺陷株（*CHO/dhFr）表达的药物有人组织性纤溶酶原激活剂

tPA、IFN－、IFN－、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ等已投放市场。可在在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白的表达水平，使外源基因高效表达。

第49页/共57页二、BHK细胞（一）一般特性：分离自幼仓鼠的肾脏（babyhamsterkidney,BHK）

成纤维样细胞，非整倍体，2n=44。（二）应用：用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白。两种重组凝血因子Ⅷ，Bayer的Kogenate

FS、AventisBehring的Helixate分别于1989和1994被FDA获准上市，1999年FDA批准NovoNordisk的重组凝血因子VIIa（NovoSeven）上市，用于治疗血友病。

第50页/共57页三、C127细胞（一）一般特性：

分离自小鼠乳腺肿瘤上皮样细胞，贴壁型生长。被牛乳头瘤病毒（bovinepolyomavirus，BPV）DNA载体转染后，细胞形态发生明显变化。（二）常用细胞系：

C127：LT细胞系：生长密度高，表达组成型大T抗原。

C127I细胞：适合于牛乳头瘤病毒DNA载体的转化。（三）应用：已表达多种外源基因，Serono公司生产rhGH