黄瓜雌核离体培养加倍技术

1/6页材料与方法

黄瓜雌核离体培育加倍技术黄瓜未受精子房离体培育体系的建立材料滑型雌性系(长、短)与中国刺瘤类型的Fl代。方法雌花采集：取未开放的黄瓜雌花，去掉花冠和花柄。75%酒精处理子房30秒，然后用10%次氯酸钙液灭菌15分钟。用无菌水冲洗3次。导培育基的三角瓶内。1963)培育基根本成分(详见附表2)为根底，依据试验设计做相应调褴。培育基中的大鼍SIGMANaOH或HCI调PH至5.8，加热溶化后分装至三角瓶，25ml／瓶，在SANYO高压灭菌器120℃，1.06Kg/cm2的压力下，灭菌15min。25℃黑暗条件下培育7天，然后移至同等温度、14hr光／l0hr黑暗条件下培育。3~4周后即可继代。继代培育基：1/2MS+BA0.5mg/L+30g/L再生植株的扩繁：自未受精子房产生的幼小胚芽，继代至1／2MS培育基15天后，形成正常小植株(根茎叶完整)，为保护其种质资源，提高种苗基数，使5cm左右的正常小植株，剪成2-3cm小段，每段含1或2节，插接于快繁培育基上。快繁培育基K：MS大量、微量、有机，FeKT/NAA(0.1/0.1mg/L)3-4个。再生植株驯化与移栽：“一步移栽法”：3-4cm深的蛭石，用除糖和琼脂的MS根本培育基浇湿，然后封口、高压灭菌；2片开放叶部位下，用剪刀剪下，将枝条直接扦插在广口玻璃瓶内的蛭石上，用薄膜封口，置于组培室架上培育：7天后松开瓶口的薄膜。再过3天去掉薄膜，再过7天左右即可将苗和瓶移至室内5天左右视苗子大小即可移栽到温室。该方法的优点是，成活率根本到达l00%，而且驯化过程格外简洁。再生植株的倍性鉴定染色体制片法R5(F1)为供体材料，通过来受精子房进展离体培育，获得约200株再生植株，定植于玻璃日光温室中，取5-6cm长的幼嫩卷须为试材，供倍性鉴定争论。方法：染色体制片方法以陈瑞阳等(1981)的去壁低渗法为根本方法，针对黄瓜的具体状况对采样时间预处理酶解去壁等环节进展优化最终确定染色体制片步骤如下：i 预处理取再生植株幼嫩卷须用0.1%秋水仙碱+0.002M8-羟基喹啉溶液处理2小时。ii 前低渗：将卷须转入0.075mo1/LKCL低渗液中，在20~25℃条件下处理30min。iii 前固定：倒去KCL溶液，用甲醇-冰乙酸(3:1)于0~5℃条件下固定40min。1%混合酶液(纤维酶和果胶酶各占1%)在25℃温箱内处理50min。后低渗：倒去酶液，用蒸馏水冲洗2-3次，转入蒸馏水中后低渗10-15min。后固定：再用配制甲醇-冰乙酸(3:1)固定30min以上。枯燥。Giemsa染色。镜检：①染色体计数：用OPTON911型显微镜观看。②染色中心直径和异染色质数目：在OlympusIX70显微镜下(400X)观看并测量染20个，求其平均值。染色中心直径的观测值乘以1.667调整为实际值。进展统计分析。叶片气孔直径和保卫细胞叶绿体数目测定法条件下，测量气孔直径大小。每基因型植株取l0片叶进展计数和测量并求其平均植。气孔直径的观测值乘以1.667调整为实际值。进展统计分析。细胞按DNA荧光染色法肉细胞游离，然后参加DN特异性荧光染料DAPI二盐酸-，6二脒基-2苯基吲哚，5µg/m1)1滴并与叶肉细胞混匀，然后在紫外光(λ=490nm)下，用Univer扫描显微分光光样品测量20个细胞核，计算平均值。植株形态观看工程包括叶片外形，花的外形，花粉发育，果实形态，种子育性等。黄瓜染色体加倍争论HM6、HM36、HM45、HM82、H-71等，双单倍体植株H4-1进展染色体加倍试验。生长点浸泡、扦插法选用不同基因型的单倍体植株，用0.5%、1%的秋水仙碱分别浸泡其生长点2h、4h后，扦插于含有养分液的蛭石中，成活后定植于温室，鉴定其倍性变化。生长点涂抹处理和浸泡处理0.2%和0.5%秋水仙素挂瓶浸泡法对剥取生长点后的单倍体植株进展浸泡处理，从9:00~16:00浸生长点7h。双单倍体幼苗加倍试验倍处理：0.2%秋水仙素；0.2%秋水仙素+1.5%DMSO；0.05%、0.1%、0.2%氟乐灵在每天8:00和18:00滴于生长点，连续处理5天。一次。株数、变异株数、加倍株数，计算成株率、变异率(变异株占处理株数的百分比)、加倍率(加倍株占处理株数的百分比)。黄瓜离体雌核发育的过程及其早期生化变化争论材料、培育基和培育方法选用31-2d2-3mm厚的下。石蜡切片观看0d、3d、6d、12d、24d、36d取培育的子房切片，承受连续石蜡切片法，爱氏苏木精染色，用Olympus相差显微镜观看并照相。方法步骤：后保存于70%的乙醇(4℃)中备用；采集春三、杂二、P66、4、1、3、A16黄瓜品种距开花前一天的未受粉子房，无菌条件下，将子房分割成5mm长的小圆块，进展接种，分别培育在Mo67、W5、M99、M100培育基中，取培育不同天数的未受粉子房，分别固定于FAA液中，固定时间>2h，后保存于70%的乙醇(4℃)中备用。70%→85%→95%→100%浓度梯度的乙醇及→60min，其中二甲苯中脱水时间视透亮程度而定。1/2的60℃石蜡、二甲苯混合后，于60℃烤箱中化蜡，将材料进展浸蜡，然后进展横、纵两种方向包埋。切片：将包埋好蜡块依据横、纵两种方向进展切片厚度为9~11μm。切片脱蜡、染色：将切片分别转入二甲苯→1/2无水乙醇、二甲苯的混合液及100%→95%→85%→70%→50%浓度梯度的乙醇中脱蜡，其中在二甲苯、1/2无水乙醇、二甲苯的混合液中放置30min，其余浓度梯度乙醇中放置3~5min，然后转入蒸馏水中后用爱60min50→70→85→95→100%1/2二甲苯、无水乙醇的混合液→二甲苯中，放置时间同下行时间。封片：最终用加拿大胶封片，供观看照相。酶活性测定0d、3d、6d、取培育在M99和W5培育基上的子房外植体，先用蒸馏水洗净，吸干外表水，再用塑料膜小袋包装后快速置于-80℃保存备用。过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的测定：酶液的提取按《现代植试验指南》(中国科学院上海植物生理争论所，1999)的方法。POD活性承受张志良(1990)的方法测定，以1min △0D470表示1个酶活性单位。SOD活性承受《现代植(中国科学院上海植物生理争论所，1999)的方法测定，以NBT的光SOD抑制50%时参加的酶量(ml)为1个酶活性单位。酶和Ca2+-ATP酶活性测定：依照李杨瑞(1987)的方法。Q酶活性测定：依照李太贵、沈波等(1997)的方法。激素含量测定-80IAA，iPA，Zr，ABA，GA3及GA4的测定按何钟佩编(1993)方法进展。可涪性蛋白食量及POD、EST同工酶可溶性蛋白含量的提取和测定2.4.5.2中POD同工酶的材料预备与提取一样，可溶性蛋白含量测定方法参考《生物化学试验原理和方法》(李建武等编，2023)。POD、EST同工酶材料预备与提取：取R12黄瓜植株子房在M99、W5培育基上离体培育，分别取0d、3d、6d…的黄瓜子房材料各1g，加2g样品提取液，冰浴研成匀桨，然后4℃下离心10min(10000r／min)，上清夜即酶液。其中POD同工酶样品提取液为pH=7.0磷酸缓冲液硫基乙醇；EST同工酶的样品提取液为pH=6.4的磷酸缓冲液+0.1%硫基乙醇(陈启林，1999)。Bio-RADMiniTrans-Blotcell稳压电泳仪和双面垂直泳槽在室温中进展电泳时分别胶浓度为120V稳压电泳3~4h。过氧化物酶同工酶承受联苯胺染色法；酯酶同工酶染色承受坚牢蓝RR盐法。同工酶电泳均重复3次。总蛋白样品的制备以分裂率较高的3号品系为供体材料，取开花前l天未受精子房，经外表灭菌后接种至M99培育基上培育，与培育的第0d、3d、6d和l0d分别取外植体2g，先用蒸馏水洗净，吸干外表水，再用塑料膜小袋包装后快速置于-80℃保存备用。参照Damerval(1986)等的方法制备总蛋白样品。/提取液(w/v)1:4的比例悬浮于-20℃的丙酮提取液中(含10%TCA，0.07%(—ME)，-20℃沉淀2h；15,000rpm，4℃条件下离心20min，弃上清液；沉淀重悬浮-20℃的丙酮中(含0.07%(—ME)，-20℃沉淀1h；15,000rpm，4℃条件下离心20min4℃下真空枯燥，然后保存于-20℃冰箱中待丙酮完全挥发后即可使用。上样前，样品按lmg.20μ1样品溶解缓冲液(1ysisbuffer)溶解，Eppendorf离心机最高速离心20min，取上清液上样。和蛋白质分子量标记均购自Phamarcia公司，聚丙烯酰胺、尿素等购自上海生工公司。双向聚丙烯藏胺凝胶电泳(IEF/SDS-PAGB)(ZEF/SDS-)技术分别特异蛋白质。电泳参照等的方法进展并加以改进。第一向等电聚焦电泳(IEF)：灌制IEF柱胶，上面注少许重蒸水隔离空气并压平胶面。柱高11.5cm，直径2mm。每管上样量100μ1(浓度5.5mg/ml，共约550mg蛋白质)。全蛋白质浓度测定承受紫外吸取差值阅历公式：蛋白质浓度(mg/m1)=1.55×0.D.2800.76×O.D.260(李立人和王维光，1991)。电极液正极为0.01MH3PO4，负极为0.02MNaOH。室温下按以下程序进展电泳：①预电泳，200V15min；300V30min；400V30min。②正式电泳，500V6h以上；600V10h：800V1.5h。电泳后，胶条用12.5%三氯乙酸(TCA)固定5min，再转移到双蒸水中漂洗两次直至胶条背景透亮为止(约5min左右)15min-20℃以下保存备用。的分别胶，再灌浓度为4%的浓缩胶。垂直平板规格20×17×0.1cm.IEF胶条用1%琼脂糖(用凝胶平衡液配酚蓝前沿距凝胶底边0.1cm时，停顿电泳并取胶。承受银染或CBBR-250染色。主要试剂配方如下：①lysisbuffer(参照Damervaleta1.，1986的方法配置)：100mlUrea(9.5M)β-Mercaptoethanol(5%)NP-40(2%)40%Ampholine(pH6.0~8.0)40%Ampholine(pH3.5~10.0)ddH2O4℃保存。②IEF胶的配方:10mlUreaArc(28.38%)-Bis(1.62%)10%NP-40ddH2O40%Ampholine(PH5.0-7.0)40%Ampholine(PH6.O-8.0)40%Ampholine(PH3.5-10.0)10%APTEMED③分别胶配方：100mlArc(29.1%)-Bis(0.9%)Tris～HCl(PH8.8，1.5M)ddH2O10%SDS10%APTEMED④浓缩胶配方：100mlArc(29.1%)-Bis(0.9%)Tris+HCl(PH6.8.0.5M)ddH2O10%SDS10%APTEMED⑤凝胶平衡液：100mlGlycerin(10%)SDS(4%)Tris—HCl(pH6.8，0.1M)

57.06g5ml2ml1.6ml0.4ml→100m15.5g1.33ml2.0ml1.97ml200μml200μml100μml10μml3.5μl100ml25.0ml33.23ml100μml100μml40μml16.5ml26.3ml55.62ml1ml1ml80μml10ml4g1.21gβ—ME(2%) 2mlddH2O →100m1⑥SDS-电极缓冲液(10×)：100mlSDS(1%) 1gTris(3.22%) 3.22gGlycine(14.1%) 14.1gddH2O →100m1银染(19