毛细管电泳法专家讲座

第4节毛细管电泳1毛细管电泳法第1页4.1、概述4.2、理论基础4.3、毛细管电泳仪4.4、毛细管电泳分离模式4.5、毛细管电泳应用2毛细管电泳法第2页4.1、概述

在电解质溶液中，位于电场中带电离子在电场力作用下，以不一样速度向其所带电荷相反电极方向迁移现象，称之为电泳。因为不一样离子所带电荷及性质不一样，迁移速率不一样，可实现分离。样品迁移速度和方向由其电荷和淌度决定。

1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；1948年，获诺贝尔化学奖；3毛细管电泳法第3页利用电泳现象对化学或生物物质进行分离分析方法和技术叫电泳法或电泳技术。

按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，所用分离柱柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。4.1.1、经典电泳分析方法4毛细管电泳法第4页

1981年，Jorgenson等用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，快速发展成为可与GC、HPLC相媲美崭新分离分析技术——高效毛细管电泳。4.1.2、毛细管电泳分析方法5毛细管电泳法第5页高效毛细管电泳在技术上采取了两项主要改进：一、采取了<0.1mm内径毛细管二、采取了高达数万伏电压毛细管采取使产生热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压能够很高。

电压升高，电场推进力大，又可深入使柱径变小，柱长增加。高效毛细管电泳柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万/米，特殊柱子能够到达数百万。6毛细管电泳法第6页分离过程

电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。

带电粒子迁移速度=电泳+电渗流；两种速度矢量和。

正离子：两种效应运动方向一致，在负极最先流出；

中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；

阴离子：两种效应运动方向相反。ν电渗流>ν电泳时，阴离子在负极最终流出。7毛细管电泳法第7页高效毛细管电泳特点1、仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶2、分析速度快、分离效率高

可在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1

min内分离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数3、操作方便、消耗少、成本低进样量极少，nL水平4、环境友好5、应用范围极广

无机物、有机物、生物小分子、中性分子；生物大分子等

8毛细管电泳法第8页4.2、理论基础4.2.1电泳

电泳是指带电离子在电场中定向移动，不一样离子含有不一样迁移速度，迁移速度与哪些原因相关？当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反电场推进力和平动摩擦阻力作用。电场力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—离子所带有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中迁移速度；f—平动摩擦系数9毛细管电泳法第9页（球形离子）

η-溶液粘度r-离子半径物质离子在电场中差速迁移是电泳分离基础。淌度μ：单位电场强度下平均电泳速度:所以，迁移速度：10毛细管电泳法第10页4.2.2、电渗现象与电渗流1、电渗流现象

当固体与液体接触时，固体表面因为某种原因带一个电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。

当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面移动，这种液体相对于固体表面移动现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着液体叫电渗流（electroosmoticflow，EOF）。11毛细管电泳法第11页2、HPCE中电渗现象与电渗流

石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-，管内壁带负电荷，形成双电层。

在高电场作用下，带正电荷溶液表面及扩散层向阴极移动，因为这些阳离子实际上是溶剂化，故将引发柱中溶液整体向负极移动，速度νEOF。12毛细管电泳法第12页

电渗流方向取决于毛细管内表面电荷性质：石英毛细管，内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。3、HPCE中电渗流方向13毛细管电泳法第13页

电渗流大小用电渗流速度νEOF表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。即

νEOF=μE电渗淌度取决于电泳介质及双电层Zeta电势，即

μ=ε0εξε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁Zeta电势。νEOF=ε0εξE实际电泳分析，可在试验测定对应参数后，按下式计算

νEOF=Lef/teoLef—毛细管有效长度；teo—电渗流标识物（中性物质）迁移时间。4、HPCE中电渗流大小14毛细管电泳法第14页5、HPCE中电渗流流形

电荷均匀分布，整体移动，电渗流流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中溶液流动为层流，抛物线流型，管中心处速度为平均速度2倍（引发谱带展宽较大）。15毛细管电泳法第15页6、HPCE中电渗流作用各种电性离子在毛细管柱中迁移速度为：

ν+=νEOF+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=νEOF-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=νEOF中性粒子运动方向与电渗流一致；普通离子电渗速度是电泳速度5-7倍，所以待测组分都能从阴极流出。（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子分离；（2）改变电渗流大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中流速；（3）电渗流微小改变影响结果重现性；在HPCE中，控制电渗流非常主要。16毛细管电泳法第16页4.2.3、

HPCE中影响电渗流原因1.电场强度影响

电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料影响

不一样材料毛细管表面电荷特征不一样，产生电渗流大小不一样。17毛细管电泳法第17页3.电解质溶液性质影响（1）溶液pH影响

对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大；pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采取缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子影响

阴离子不一样时，毛细管中电流有较大差异，产生焦耳热不一样。

缓冲溶液离子强度，影响双电层厚度、溶液黏度和工作电流，显著影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。18毛细管电泳法第18页19毛细管电泳法第19页4.温度影响

毛细管内温度升高，使溶液黏度下降，电渗流增大。温度改变来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流经过时，产生热量；HPCE中焦耳热与背景电解质摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每改变1K，将引发背景电解质溶液黏度改变2%～3%；20毛细管电泳法第20页5.添加剂影响（1）加入浓度较大中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流大小和方向；加入阳离子表面活性剂可改变电渗流方向。

（3）加入有机溶剂可改变电渗流大小。21毛细管电泳法第21页4.2.4、淌度

淌度：带电离子在单位电场下迁移速度；淌度不一样是电泳分离基础。1.有效淌度(effectivemobility)μef溶液中离子电泳淌度μef=∑aiμi（不考虑电渗流）

ai—溶质i解离度；μi—溶质i在解离状态下绝对淌度2.表观淌度μap离子在实际分离过程中迁移速度（表观迁移速度）：

νap=μapE

μap=μef+μEOF22毛细管电泳法第22页4.2.5、

HPCE中参数与关系式

1.迁移时间（保留时间）

HPCE兼含有电化学特征和色谱分析特征。相关色谱理论也适用。V—外加电压；L—毛细管总长度；2.分离效率（塔板数）

在HPCE中，仅考虑纵向扩散，σ2=2Dt

扩散系数小溶质比扩散系数大分离效率高，分离生物大分子依据。23毛细管电泳法第23页3.分离度

影响分离度主要原因；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：24毛细管电泳法第24页4.2.6、影响分离效率原因—区带展宽1.纵向扩散影响

在HPCE中，纵向扩散引发峰展宽：σ2=2Dt由扩散系数和迁移时间决定。大分子扩散系数小，可取得更高分离效率，大分子生物试样分离依据。2.进样影响

当进样塞长度太大时，引发峰展宽大于纵向扩散。分离效率显著下降；实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度1%～2%。25毛细管电泳法第25页3.焦耳热与温度梯度影响

电泳过程产生焦耳热可由下式计算：m—电解质溶液摩尔电导；I—工作电流：cm—电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，造成区带展宽。改进方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；26毛细管电泳法第26页4.溶质与管壁间相互作用

存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多疏水基，吸附问题尤其严重，是当前分离分析该类物质一大难题。细内径毛细管柱，首先有利于散热，另首先比表面积大，又增加了溶质吸附机会。

27毛细管电泳法第27页4.3、毛细管电泳仪4.3.1、仪器流程与主要部件

电压：0～30kV；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；激光诱导荧光检测器可检测到：10-19～10-21mol28毛细管电泳法第28页1.高压电源（1）0～30kV稳定、连续可调直流电源；（2）含有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；2.毛细管柱

（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；外涂覆聚酰亚胺保护层。检测窗口制作。（2）规格：内径25～100μm，外径150～400μm；长度<=1m29毛细管电泳法第29页3.缓冲液池

化学惰性，机械稳定性好；4.检测器

要求：含有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；

类型检测限/mol特点紫外-可见

10-13～10-15

加二极管阵列，光谱信息荧光

10-15～10-17灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光10-18～10-21灵敏度极高，样品需衍生电化学

10-17～10-19样品需有电活性30毛细管电泳法第30页4.3.2、毛细管电泳进样方式

进样量：毛细管长度1%-2%；纳升级、非常小；1.流体力学进样方式

（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样31毛细管电泳法第31页

毛细管一端插入样品瓶，加电压；2.电动进样方式

进样不均：电歧视现象，淌度大离子比淌度小进样量大；离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反离子可能进不去；尤其适合黏度大试样；

32毛细管电泳法第32页4.4、毛细管电泳分离模式4.4.1、毛细管区带电泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

带电粒子迁移速度=电泳和电渗流速度矢量和。正离子：两种效应运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；

阴离子：两种效应运动方向相反；ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最终流出,在这种情况下,不但能够按类分离,同种类离子因为差速迁移被相互分离。最基本、应用最广分离模式；33毛细管电泳法第33页

1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度到达临界浓度，形成一疏水内核、外部带电胶束。4.4.2、胶束电动毛细管色谱

micellarelectrokineticchromatography，MEKC

在电场力作用下，胶束在柱中移动。加入十二烷基磺酸钠34毛细管电泳法第34页

2.电泳流和电渗流方向相反，且ν电渗流

>ν电泳，负电胶束以较慢速度向