多酚化合物对多肽淀粉样纤维化的抑制作用,有机化学论文

多酚化合物对多肽淀粉样纤维化的抑制作用,有机化学论文很多蛋白质或多肽在一定条件下能够构成淀粉样纤维，至少20多种人类疾病如阿尔茨海默病、帕金森氏病、家族性淀粉样神经病变以及Ⅱ型糖尿病等与此类淀粉样纤维沉积有关[1~4].胰岛素是一种由51个氨基酸残基组成的多肽，极易构成淀粉样纤维，通常将其作为研究多肽淀粉样纤维化、挑选抗纤维化药物以及纤维细胞毒性分子机制的模型分子[5].固然当前尚无证据表示清楚任何疾病与胰岛素纤维化有关，但在临床应用中，胰岛素在生产、储存经过中以及在注射部位构成的纤维可能对病人产生免疫原性[6].为抑制蛋白质淀粉样纤维化，溶解或者毁坏淀粉样纤维构造被以为是治疗相关疾病的有效途径。多酚化合物，十分是一些天然多酚类物质能够抑制蛋白质的纤维化[7~9],并能够毁坏成熟的纤维构造，将其转变为无定形聚集体，降低纤维的细胞毒性作用[10].这些多酚的抗多肽纤维化作用被以为既与其多环和多羟基构造有关，可以能与其抗氧化作用或促氧化作用有关[11,12],但详细作用机制尚无定论。本文采用牛胰岛素作为模型分子，探寻求索了几种构造相近的简单多酚化合物对多肽淀粉样纤维化的抑制作用，以期从这些化合物的构效关系来揭示多酚类化合物抗多肽淀粉样纤维化的分子机制。1试验部分1.1试剂与仪器牛胰岛素〔分子量5733〕、硫黄素〔ThT〕、氯化硝基四氮唑蓝〔NitroblueNBT〕、酚化合物及对苯醌购自Sigma-Aldrich公司；电泳相关试剂购自Bio-Rad公司；其它试剂均为国产分析纯。LS-55型荧光分光光度计〔美国Perkin-Elmer公司〕;JEM-1400型透射电子显微镜〔日本JEOL公司〕.1.2实验经过1.2.1胰岛素淀粉样纤维的制备用20mmol/L盐酸溶液〔pH=1.7〕配制100mol/L牛胰岛素水溶液，参加不同浓度的酚化合物，于50℃水浴中孵育5d,按一定的时间间隔取样并在4℃保存备用。1.2.2ThT荧光检测用10mmol/L磷酸盐缓冲液〔pH=7.0〕配制1mmol/LThT溶液，于4℃避光保存备用。取10L孵育的胰岛素样品，加至10mmol/LTris-HCl溶液〔pH=8.0〕中，再参加30LThT溶液使其终浓度为10mol/L,振荡10s左右，用荧光分光光度计记录荧光强度〔激发波长为440nm,发射波长为484nm〕.1.2.3透射电子显微镜〔TEM〕观察聚集体形态将制备的胰岛素纤维或者聚集体用二次蒸馏水稀释5倍，取15L滴于镀膜铜网上，静置10min后用滤纸沿边缘吸干，滴加15L醋酸铀〔质量分数为2%〕染色10min.用透射电子显微镜观察纤维形态并拍照〔电压80kV〕.1.2.4SDS-凝胶电泳及电转分析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳〔SDS〕采用分离胶〔质量分数为15%〕在Tricine缓冲体系〔pH=8.2〕中进行，胰岛素加样量为10g,用考马斯亮蓝染色。采用GEHealthcare电转盒将凝胶上的条带转至聚偏氟乙烯〔PVDF〕膜上，在碱性〔pH=10〕条件下由NBT染色。2结果与讨论实验条件下，胰岛素可在约4~5d构成成熟的淀粉样纤维，纤维的生长经过采用ThT荧光法监测。ThT是一种能够与淀粉样纤维的片层构造特异性结合的荧光探针，当与淀粉样纤维结合时，其在440nm波长光激发下产生484nm的特征荧光发射峰。与大多数蛋白质纤维化经过类似，胰岛素的纤维生长经过也具有成核-聚合的动力学特征[13],即纤维化主要包括成核、生长和成熟3个阶段，ThT荧光曲线表现为S型特征[见图1〔A〕].由图1〔A〕可见，各种酚化合物对胰岛素的淀粉样纤维化作用不同。200mol/L的苯酚和间苯二酚对胰岛素纤维化有一定的促进作用，相应的ThT荧光在1.5d后开场加强，表示清楚其具有较短的成核期；与之相比，一样浓度的邻苯二酚和对苯二酚则对胰岛素纤维化表现出明显的抑制作用，相应的ThT荧光在孵育3d后开场略有上升，第5d的荧光强度仅为胰岛素对照样品的27%和19%.由于邻苯二酚和对苯二酚的纤维化抑制作用可能与其氧化产物醌中间体相关，故采用对苯醌同时进行对照分析。如此图1〔A〕所示，在200mol/L对苯醌存在下，胰岛素纤维化几乎被完全抑制，整个孵育经过中ThT荧光强度无明显增加。邻苯二酚、对苯二酚和对苯醌对胰岛素淀粉样纤维化的抑制作用与浓度呈正相关。对苯二酚的浓度效应如此图1〔B〕所示，可见较低浓度的对苯二酚可延缓胰岛素的纤维化，包括增加延迟期时间和降低纤维的生长速度。邻苯二酚和对苯醌的浓度效应与此类似，但对苯醌的抑制作用比2种苯酚强，100mol/L对苯醌即可完全抑制胰岛素纤维的生长[图1〔C〕].酚类化合物对胰岛素淀粉样纤维化的作用可进一步由TEM表征结果〔图2〕证实。作为对照的成熟胰岛素纤维的直径为5~35nm,长度分布为600~3000nm[图2〔A〕],能与刚果红结合并在偏振光下显现出特征的黄绿色，具有淀粉样聚集体的特性。当胰岛素与200mol/L的苯酚[图2〔B〕]或间二苯酚[图2〔C〕]共孵育5d后，纤维密度比对照样品有所增加，与ThT荧光结果一致；而一样浓度的邻苯二酚[图2〔D〕]和对苯二酚[图2〔E〕]则明显抑制纤维的生成，只能观察到少量的细短纤维；100mol/L对苯醌即可完全抑制纤维的生成，故仅能观察到一些小的无定形聚集体[图2〔F〕].研究表示清楚，天然多酚化合物的抗多肽纤维化作用与其氧化复原性质有关[9,10],Hirohata等[14]也报道天然多酚的氧化产物通常具有更强的抑制纤维化作用。在本文选用的4种酚化合物中，邻苯二酚和对苯二酚可抑制胰岛素纤维化，而苯酚和间苯二酚则无此作用，这可能与前2种化合物具有更低的氧化复原电位，并且在氧化经过中易于构成醌类产物有关。多酚经氧化后的醌类产物具有较高的反响活性，可修饰多肽链中的一些残基，如氨基、巯基和一些杂环残基等[15,16].电转-NBT染色实验是一种特异性检测醌修饰多肽的方式方法[17].凝胶电泳分离的多肽经电转移至PVDF膜上，在碱性条件下，NBT与醌修饰多肽反响转变为蓝色不溶物。该反响具有较高的特异性和灵敏度，常用于生物样品中醌修饰多肽的分析鉴定。图3示出了在酚化合物和苯醌存在下，孵育5d的胰岛素聚集体的SDS电泳[图3〔A〕]和相应的电转-NBT检测结果[图3〔B〕].图3〔A〕泳道1和2分别是未经孵育的胰岛素单体和孵育5d的胰岛素成熟纤维，可见在SDS的作用下，纤维被解聚为胰岛素单体，不同的是，在泳道2胰岛素单体上方可观察到少量呈拖尾状的聚集体；苯酚〔泳道3〕和间苯二酚〔泳道5〕可促进这种SDS不溶聚集体的构成。该多聚体的构成能否与淀粉样纤维化有关，当前尚不清楚。与之相比，参加邻苯二酚〔泳道4〕、对苯二酚〔泳道6〕和苯醌〔泳道7〕的样品除了少量二聚体外，在考马斯亮蓝染色条件下观察不到拖尾状的多聚体。NBT检测结果表示清楚，与邻苯二酚、对苯二酚和苯醌共孵育5d的胰岛素可与NBT反响生成紫红色产物，表示清楚胰岛素分子被醌所修饰；而与苯酚和间苯二酚共孵育的胰岛素则无此特征的紫红色。结合ThT荧光和TEM结果能够推断，邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化的抑制作用与其转变为醌中间体，进而与多肽链结合有关。在SDS电泳和充分透析的条件下，醌仍然能够与胰岛素分子严密结合，这种结合能否与共价作用有关，尚需进一步实验证实。为了进一步证实上述结论，在制备胰岛素聚集体之前，在样品中充分通入氮气，以除去溶液中的氧，然后在密闭条件下，根据前述条件孵育5d.ThT荧光结果[图4〔A〕]显示，在无氧条件下，邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化的抑制作用显着降低，表现为最终孵育产物具有较强的ThT荧光；而苯酚和间苯二酚与有氧条件下一样，对胰岛素纤维化无抑制作用。TEM表征结果表示清楚，在无氧条件下，与200mol/L邻苯二酚[图4〔B〕]和对苯二酚[图4〔C〕]共孵育5d的胰岛素具有通常情况下的纤维形态和密度，即邻苯二酚和对苯二酚在这里条件下无抑制胰岛素纤维化的作用，这与ThT荧光结果相符。另外，对上述孵育5d的样品进行电转-NBT检测发现，在无氧条件下参加所有酚化合物的样品均不能被NBT染色〔数据未给出〕,即未生成醌修饰胰岛素。上述结果充分讲明，酚化合物经氧化构成醌中间体并对多肽链修饰是其抗多肽纤维化的主要途径。表没食子儿茶素没食子酸酯〔Epigallocatechingallate,EGCG〕为绿茶的主要成分，是最有希望成为多肽纤维化相关疾病治疗药物的天然多酚化合物。在抑制-淀粉样肽及突触核蛋白等纤维化经过的研究中，可观察到EGCG构成醌中间体并对多肽修饰后的产物[18~20].但这种修饰在纤维化抑制经过中能否具有重要作用，仍然难以确定。当前，对天然多酚的抗多肽纤维化的分子机制多采用完好的多酚分子与多肽链的作用模型[18].事实上，无论是在体实验还是体外实验，多酚化合物在介质中的稳定性特别有限，充分考虑其氧化产物醌中间体的作用是特别必要的。3结论研究了几种具有单环构造的简单酚化合物对胰岛素纤维化