高致病性禽流感(H5N1)病毒感染模型的制作步骤及方法

高致病性禽流感(H5N1)病毒感染模型的制作步骤及方法禽流感(avianinfluenza,Al)是由A型流感病毒(avianinfluenzaviruses,AIV)引起的一种禽类的急性、高度接触性、烈性传染病，可引起禽类的感染或疾病综合征。该病毒属正黏病毒科、流感病毒属，其含有神经氨酸酶和血凝素，可凝集某些动物的红细胞，对消化道、呼吸道系统具有致病性。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染，而家养的鸡和火鸡引起的危害为严重，国外报道，已发现带毒鸟类达88种。根据其对易感鸡致病性强弱，可将禽流感病毒分为高致病性AIV(如H5N1等)和低致病性AIV(如H9N2等)。火鸡、鸡、鸭和鹅自然状态下容易感染禽流感病毒，是常用的实验动物。其他可用作AIV人工接种的实验动物有：雪貂、猫、仓鼠、小鼠、猴、水貂及猪。1啮齿类动物模型⑴复制方法4~6周龄SPF级ICR小鼠或NIH小鼠。首先将病毒无菌接种于10日龄鸡胚的尿囊腔，病毒毒株为A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)，待活化增殖后，病毒的血凝滴度可达到1:256。将小鼠麻醉后，经其鼻腔接种AIV,接种量为0.1ml/只，然后通过模型动物体温、体重、临床症状、病理变化、病毒分离和抗体测定进行比较分析。接种后ICR及NIH小鼠的肺脏肉眼可见，充血和水肿，肺体积变大，肺组织表面局部有轻度实变，呈现斑点状充血；镜下病理组织学观察可见，肺间质充血，血管周围有炎症细胞浸润；细支气管内充血，部分管壁黏膜上皮细胞坏死、脱落(2)模型特点机体呼吸道是AIV病毒的主要感染途径，敏感动物可出现支气管和肺组织内明显病理变化；部分动物尚可出现体液免疫反应，有接近1/2的感染小鼠可检测到AIV抗体，且出现抗体的时间为接种后第6日。部分动物体内有病毒复制，大部分ICR和NIH模型小鼠分离到AIV,ICR和NIH小鼠对AIV敏感，较适宜作为AIV小动物模型。(3)比较医学接种感染后ICR小鼠和NIH小鼠均出现较为明显的临床症状，表现为反应迟钝、食欲减退、呼吸急促，出现皱毛、弓背等现象，并日益严重；体重与体温均呈降低趋势，其临床症状及病理变化比较典型。而人感染禽流感病毒后的主要症状表现为发热，体温大多持续在39C。以上，可伴有鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、肌肉酸痛和全身不适。在实验过程中近半数接毒小鼠死亡。模型动物临床症状和人的临床症状并不完全相同，但组织病理变化基本相似。到目前为止，人工感染途径主要有鼻腔、气管、结膜、皮下、肌肉等，模型动物的发病率和临床症状受多种因素(动物易感性、病毒毒力、接种途径和动物年龄等)的影响。2非人灵长类动物模型复制方法采用“环甲膜穿刺术”接种病毒。恒河猴取仰卧位，头尽量后仰，在甲状软骨与环状软骨之间确定环甲膜的位置；在锁骨中线处，与皮肤成35°~45°角向足部方向进针，可用16号注射针头刺向环甲膜进入气管腔，经气管注射鸡胚培养的禽流感H5N1病毒(病毒血凝滴度达1：256以上，毒株为ACGoose/Guangdong/11961H5N1)感染恒河猴，观察恒河猴染毒后出现的临床体征，用显微计数法检测外周血白细胞的动态变化，用ELISA检测禽流感病毒特异性抗体变化规律，用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞及其亚群的动态变化。模型动物以肺部损伤为主，伴多器官病变。肺部的病变主要表现为弥漫性肺泡损伤，先后经历渗出期、增生期和纤维化期；在肝脏、肾脏和中枢神经系统中也观察到变性、坏死等病理变化。模型特点接种病毒后动物急性发病，临床表现为发热，呼吸困难，精神萎靡，活动减少，食欲下降，并有咳嗽和紫绀等，肺部听诊模型动物双肺可闻及干、湿音。镜下病理组织学观察以肺病理损伤变化为主，伴多器官病变；肺组织病变主要表现为弥漫性肺泡损伤，可先后出现渗出期、增生期和纤维化期；在肝脏、肾脏和中枢神经系统中也可见变性、坏死等病理变化。病毒仅在模型动物的呼吸系统中复制，不在呼吸道以外的组织器官中复制；肺内支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和肺巨噬细胞是禽流感病毒侵犯的主要细胞类型。接种感染早期，模型动物外周血白细胞总数、淋巴细胞数可出现短暂的下降，而中性粒细胞数则先升后降，但均于感染第7日后逐渐恢复至正常水平。感染后第7~11日，机体抗体水平可持续快速升高；感染第11日后，抗体水平呈渐进性缓慢升高趋势(观察到染毒后50d为止)。感染后模型动物机体细胞免疫功能受损，表现为CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞均出现短暂的下降，但这种细胞免疫功能受损是可逆的，至感染第7日后可逐渐恢复回升正常。比较医学恒河猴感染后的临床特点、病理变化