病原生物与免疫学实验教材 实验五教学课件

实验五

肠道杆菌实验内容操作肥达试验示教粪便肠道致病菌的分离和鉴定实验目的熟悉肥达试验的操作方法、结果观察及分析熟悉肠道杆菌在选择鉴别培养基上的生长特点了解粪便标本肠道杆菌的分离鉴定肥达试验(WidalTest)原理：用已知伤寒沙门菌O、H抗原，以及甲型副伤寒、肖氏沙门菌、希氏沙门菌H抗原的诊断菌液与受检血清作定量凝集试验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。用途：辅助诊断伤寒，副伤寒方法：取小试管32支，分成4排，每排8支，依次标号。于小试管内各加入0.5ml生理盐水。在每一排第1管中各加患者血清0.5ml，吸打混匀，吸取0.5ml加入第2管作对倍稀释……依次稀释至第7管弃去0.5ml，第8管为对照。2~3排按同法稀释。按8.7.…1列的顺序，分别对第1排各管加入伤寒H抗原0.5ml；第2排各管加入O抗原0.5ml；同样对第3排各管加甲型副伤寒（PA）H抗原0.5ml；第4排各管加乙型副伤寒（PB）H抗原0.5ml。将各管混匀，置37℃水浴箱中16~18小时后观察结果。肥达试验结果观察根据凝集反应的强弱，分别以“++++、+++、++、+”记录：++++：液体清澈透明，菌体全部被凝成块，沉于管底。+++：液体较透明，大部分菌体被凝集而沉于管底。++：液体稍透明，管底有少量凝集沉淀物。+：液体较混浊，可见极少量凝集物。-：液体混浊，细菌因重力下降于管底呈边缘光滑圆点（与对照管相似）。血清效价（或滴度）：能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“++”凝集）的血清最高稀释倍数，称为血清的效价。血清的效价代表着血清中抗体的含量，其效价愈高，所含抗体的量愈多。如血清最低稀释倍数（1∶40）仍无凝集，则视为阴性或效价低于1∶40；如血清的最高稀释倍数（1∶1280）仍完全凝集，则示血清效价高于1∶1280。粪便标本肠道杆菌的分离鉴定克氏双糖铁培养基尿、靛、动培养基分析结果SS平板EMB平板挑取可疑菌落玻片凝集试验粪便SS平板－分离肠道病原菌的强选择培养基成分和作用：基础培养基：提供氮源和碳源胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱。乳糖，中性红（pH6.8-8.0，红→橙黄）：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质→菌落淡黄色；大肠杆菌分解乳糖产酸，菌落呈红色病原菌:小,无色,半透明非致病菌:大,红色EMB（EosinMethylBlue)平板－分离肠道病原菌的弱选择培养基成分和作用：基础培养基：提供氮源和碳源伊红、美蓝：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱。乳糖，伊红、美蓝：致病菌不分解乳糖→菌落无色半透明；大肠杆菌分解乳糖产酸，菌落呈紫黑色病原菌:半透明,无色非致病菌:紫黑色克氏双糖铁培养基接种方法如何观察上层含乳糖部分乳糖发酵：致病菌红色，非致病菌黄色H2S然后观察下层发酵葡萄糖（产酸产气）动力乳糖硫酸亚铁固体葡萄糖半固体指示剂:酚红

乳糖葡萄糖硫化氢尿素靛基质动力大肠杆菌黄色

+

--++痢疾杆菌红色

+

--+/--伤寒杆菌红色

+

+/---+副伤寒杆菌红色+