微生物知识和环境控制要求内容

关于微生物知识和环境控制要求内容第1页，共69页，2023年，2月20日，星期四第2页，共69页，2023年，2月20日，星期四第3页，共69页，2023年，2月20日，星期四

第一部分微生物知识第4页，共69页，2023年，2月20日，星期四什么是微生物？定义：微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。第5页，共69页，2023年，2月20日，星期四微生物的分类具有细胞结构的微生物没有细胞结构的微生物：病毒

原核生物（由原核细胞构成的）

真核生物（由真核细胞构成的）真菌显微藻类原生动物细菌放线菌

第6页，共69页，2023年，2月20日，星期四★细菌：肺炎球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌★真菌：蘑菇、霉菌、酵母菌、念珠菌（湿疹）★放线菌：从放线菌中发现链霉素、土霉素★支原体：肺炎支原体★衣原体：沙眼★立克次体：斑疹伤寒★螺旋体：梅毒★病毒：甲、乙肝病毒，麻疹病毒，流感病毒。微生物种类－八大类第7页，共69页，2023年，2月20日，星期四★细菌：是一类细胞细而短、直径一般为0.5~5.0μm，结构简单、细胞壁坚韧，以二分裂方式无性繁殖的原核微生物，分布广泛。生长最适温度为30~35℃，主要去除方法有紫外杀菌法、滤膜过滤法及高温杀灭法等。个别细菌如：嗜热脂肪芽孢杆菌，能在121℃条件，可耐受4~5min。灭菌柜验证中作为生物指示剂最适合生长条件为55~60℃微生物种类第8页，共69页，2023年，2月20日，星期四★真菌：包括单细胞与多细胞两类，单细胞真菌呈圆形或卵圆形称为酵母菌；多细胞真菌由菌丝和孢子组成，称为丝状菌或霉菌。真菌生长的最适的温度为23～28℃，一般加热60~70℃1小时即被杀死，用一定浓度的酒精及甲醛也可杀死。

★病毒：属非细胞型微生物，在自然界分布非常广泛，可在人、动物、植物、真菌和细菌中寄居并引起感染。病毒是体积最小、结构最简单的微生物，它仅有一种核酸（DNA或RNA）作其遗传物质。微生物种类第9页，共69页，2023年，2月20日，星期四微生物体积小、面积大适应强、变异频生长旺、繁殖快吸收多、转化快分布广、种类多微生物五大共性个体极其微小，必须借助显微镜放大几倍、几百倍、上千倍，乃至数万倍才能看清。食谱广泛，凡是动植物能利用的营养，微生物都能利用，大量的动植物不能利用的物质，甚至剧毒的物质，微生物照样可以视为美味佳肴。二分裂是细菌最普遍、最主要的繁殖方式。能耐0～－196℃的低温，可在250～300℃的高温条件下正常生长。耐药性产生的原因。微生物几乎无处不有，无孔不入，地球上有200万生物，其中微生物有20万种之多。第10页，共69页，2023年，2月20日，星期四微生物的营养营养元素碳源是构成细胞的重要物质。氮是组成蛋白质和核酸的重要元素。细菌所需无机盐包括磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、氯、锰、锌、钴、铜等。生长因子是某些微生物生长发育所必需，而其自身又不能合成的一类营养物质。包括维生素、嘌呤和嘧啶。水占细胞浆的70%～90%，是细胞的重要组成成分。第11页，共69页，2023年，2月20日，星期四实验室中微生物的生长基质★培养基：人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合体。培养基中主要包含了微生物生长所需要的碳源、氮源、无机盐及微量元素。第12页，共69页，2023年，2月20日，星期四

影响微生物生长繁殖的因素因素营养温度pH渗透压其他水份其他因素：

温度氧气

厌氧光照

水份等第13页，共69页，2023年，2月20日，星期四微生物存在水空气衣服地面废水排水口洗手池嘴头发皮肤鼻子肠道食物昆虫动物等等第14页，共69页，2023年，2月20日，星期四

杆菌(大肠杆菌)大肠杆菌(带鞭毛)微生物的主要类群杆菌(碳疽)沙门氏菌第15页，共69页，2023年，2月20日，星期四葡萄球菌微生物的主要类群链球菌弧状菌四叠球菌第16页，共69页，2023年，2月20日，星期四黑曲霉菌微生物的主要类群丝状真菌真菌的繁殖：分生孢子第17页，共69页，2023年，2月20日，星期四微生物数量时间衰亡期稳定期对数生长期延缓期细菌能否无限繁殖下去？微生物的生长规律★延滞期：细胞变大，细胞内RNA含量增高，培养基不丰富时延滞期较长。★对数期：细胞分裂最快，代谢旺盛，生长速率由营养成分决定。★稳定期：总体数量保持不变，开始产生代谢产物或开始形成芽孢。★衰亡期：由于代谢毒素的积累，死亡数超过新生数。第18页，共69页，2023年，2月20日，星期四微生物的益处啤酒，葡萄酒的生产面包酵母的生产奶酪的生产醋的生产酸奶的生产维生素的生产类固醇的生产抗菌素、干扰素的生产分解废物，循环利用帮助肠道中的食物消化除虫&微生物的害处导致伤口感染导致胃肠不适引起感冒，咳嗽尿道感染败血症癌症脑脊膜炎破伤风艾滋病第19页，共69页，2023年，2月20日，星期四热原与内毒素许多细菌、病毒和真菌（如酵母菌）都能产生热原。★热原：是微量即可引起恒温动物体温异常升高的物质的总称主要物质为细菌内毒素、胞壁酰二肽及其他抗原抗

体复合物等。（家兔法进行检查）★细菌内毒素：一般指革兰阴性细菌细胞壁的结构成分，主要是脂多糖。（鲎试剂法进行检查）

①耐热性：250℃加热30min，才可彻底破坏；②滤过性：其体积小，约在1~5nm之间；③具有水溶性及不挥发性，可被活性碳吸附；④能被强酸、强碱及氧化剂破坏。第20页，共69页，2023年，2月20日，星期四消毒、灭菌概念概念杀死所有微生物包括芽孢和繁殖体杀死病原微生物阻止或抑制微生物生长繁殖无活的微生物2.消毒3.防腐4.无菌第21页，共69页，2023年，2月20日，星期四消毒和灭菌前提条件：

清洗干净!第22页，共69页，2023年，2月20日，星期四

灭菌（消毒）类型温度与时间杀菌范围灭菌物品干热灭菌火焰灭菌火焰灼烧全部微生物耐热物品、接种环、试管口等热空气灭菌160℃2h玻璃器皿、金属用具、等耐热物品湿热灭菌高压蒸汽灭菌法121℃15-30min培养基、生理盐水、玻璃器皿等115℃15-20min湿热灭菌比干热效果好水蒸汽穿透力强蒸汽凝结成水，放出潜热，提高物体温度菌体蛋白质吸收水分易凝固热力灭菌第23页，共69页，2023年，2月20日，星期四化学消毒类别名称常用浓度应用范围作用机理醇类乙醇70-75％皮肤、体温计、器械消毒脱水、蛋白质变性表面活性剂新洁尔灭0.05-1％皮肤、器械消毒破坏细胞膜、改变通透性酸类乳酸0.33-1mol/L空气消毒/

氧化剂过氧乙酸0.2-0.5%（需严格控制浓度）塑料、玻璃、纺织原料及人造纤维制品；也适用于食品表面消毒（水果、蔬菜、蛋类）和环境地面消毒与蛋白质活性基团反应，酶失活氯制剂漂白粉（次氯酸钙）0.5-1.2%饮用水、厂房和用具，澄清溶液可用水果和蔬菜消毒杀死细菌芽孢卤素氯气0.2-1ppm饮用水消毒同上酚类来苏尔1-2％手、皮肤消毒同上3-5％器械、地面消毒第24页，共69页，2023年，2月20日，星期四

第二部分环境控制要求第25页，共69页，2023年，2月20日，星期四药品生产中微生物控制

为什么要对药品生产进行微生物控制？

微生物可以致病甚至致命。特别是注射剂的危害（乙肝疫苗，刺五加）。如果细菌得到了必要的养料、一定量的水份和合适的温度，它们就能迅速繁殖，它们繁殖的速度快得惊人。通常一个细菌在仅仅24小时后可产生出281兆(百万)个的细菌。第26页，共69页，2023年，2月20日，星期四主要的微生物污染源人员设备原辅料

法环第27页，共69页，2023年，2月20日，星期四人员与微生物人员是洁净室中的最大污染源。人在代谢过程中会释放和分泌污染物，人体表面、衣服能沾染、携带污染物，在洁净室内的各种动作也会产生微粒和微生物。GMP对人员有着严格的要求。第28页，共69页，2023年，2月20日，星期四★防范措施：1.建立个人健康档案新员工入厂全面体检，直接接触药品的生产人员每年至少体检一次，如发现有传染疾病应立即隔离。2.清洁的个人卫生①勤洗澡、理发、剪指甲②正确的洗手、更衣流程及防护方式3.洁净区内的自我约束①不佩带首饰，不化妆②进出次数应可能地少，在操作过程中应减小动作幅度③规范各类操作及避免违规行为第29页，共69页，2023年，2月20日，星期四人员需要规范或注意的部分净化工作服穿戴第30页，共69页，2023年，2月20日，星期四一次更鞋：阻断外界粘在鞋底的垃圾、颗粒及微生物。相对而言，脚底是最脏的部分。脱去外套：阻断外界沉降在外套上的颗粒和微生物。一更洗手：规范的洗手能消除手部皮肤的污垢和大部分的微生物。洗

手一定要用洗手液和充足的流水。二更带口罩：阻断鼻腔、呼吸道的微生物发散，洁净区内不能脱下口罩。带发套：阻断头发、头皮表面的微生物发散。保证发套完整的包裹头发。穿连体服：阻断体表皮肤的微生物发散。洁净区内不能解开连体服。手消毒：再次消除手部的细菌和微生物。75%的酒精能杀灭手部95%以上的

微生物。人员进入洁净区的程序第31页，共69页，2023年，2月20日，星期四

NoYes大家来找茬---1第32页，共69页，2023年，2月20日，星期四33头发应完全包在帽子内YESNONO大家来找茬---2第33页，共69页，2023年，2月20日，星期四不能配戴手表、首饰大家来找茬---3第34页，共69页，2023年，2月20日，星期四定时或在任何关键操作前，应消毒手套第35页，共69页，2023年，2月20日，星期四36填写批记录后，手套应消毒第36页，共69页，2023年，2月20日，星期四手的卫生每只手可携带40万个细菌；刚洗过的手，每平方厘米也可检验出3200个细菌。1～10万个细菌/1cm2皮肤表面!用流水（如自来水）洗手，能使手上的致病微生物减少80%；用皂液充分洗手，再用自来水冲洗能使致病微生物减少95%。洗手后正确使用消毒剂能使致病微生物减少到99%。洗手的重要性:第37页，共69页，2023年，2月20日，星期四洗手的正确方法第38页，共69页，2023年，2月20日，星期四1.用清水润湿双手及手腕以上10厘米2.均匀涂上

洗手液

3.掌心相对，手指并拢相互摩擦

4.手心对手背沿指缝相

互摩擦交换进行

5.掌心相对，双手交叉，

沿指缝相互摩擦

6.弯曲各手指关节，在另一手掌旋转搓擦，交换进行

7.一手握另一手大拇指旋转搓擦，交换进行8.搓洗手腕，交换进行。

9.将手及手腕用水冲洗干净，最后才可以用干净的手将干净的水龙头关掉。10.然后在烘手器下吹干第39页，共69页，2023年，2月20日，星期四洗手手的细菌对照实验未洗的手

漂洗的手

(只用清水)洗净的手洗净的手

(用皂液)(用消毒剂)

第40页，共69页，2023年，2月20日，星期四设备与微生物

设备的卫生应从设备的设计开始，要求产尘少、脱落粒子少、易清洗、消毒和灭菌。设备与物料的接触面不得与物料反应，不得吸附物料，设备的内表面材质要平整、光滑，凹凸不平的区域不仅不易清洗，而且易存留残液等，它将成为微生物繁殖滋生的场所。管道的安装要避免批与批之间的交叉污染，管道要能定期清洗消毒。★防范措施：①建立相应的设备清洁保养制度及规程②保持一贯的清洁状态，发现污渍、污水、残余物等应立即清除③机修人员在线维修设备时，应注意操作尽量减少对药品产生污染④对直接接触药品的设备进行清洁验证第41页，共69页，2023年，2月20日，星期四物料与微生物

对于物料卫生的问题，从供应商的审计、物料进厂后的检验、使用全过程，均要严格按照GMP规定的卫生要求进行。我公司物料主要包括：原辅料、接口、盖子及工艺用水。★防范措施：①正确的原辅料的脱包、消毒、运送(容器)及投加操作。②正确的胶塞清洗流程。③对精洗残余水、胶塞清洗水及工艺用水的定期监测。④原辅料使用前的抽检。第42页，共69页，2023年，2月20日，星期四操作方法与微生物

洁净区人员的操作是否规范，影响药品灭菌前的微生物负荷，最终将影响产品的无菌保证值(SAL)。F0≥6×D121℃+D121℃×lgN0

F0:标准灭菌时间;

N0：产品灭菌前的带菌量；D121℃：在121℃下杀灭90%微生物所需时间。

★防范措施：①制定日常操作的规范并严格执行。②直接与药品有接触的操作应带无菌手套并频繁冲洗，操作过程中动作不宜过大。③加强对微生物知识的了解，增强无菌操作意识。第43页，共69页，2023年，2月20日，星期四环境与微生物

环境中的微生物种类繁多，主要有附着于尘埃上的从地面飞起的球菌属（包括八叠球菌属在内的好氧菌）；形成孢子的好氧性杆菌（如枯草芽孢杆菌）；青霉等霉菌的孢子等。微生物的存在严重影响着药品生产的安全，依次必须加以严格控制。

★防范措施：1.合理的厂房布局及高效的空气过滤系统2.完善的洁净区日常卫生管理3.每周进行空气消毒(臭氧熏蒸)4.定期对洁净环境进行监测第44页，共69页，2023年，2月20日，星期四洁净度测定包括：

微生物

-浮游菌

悬浮粒子

-沉降菌

新版GMP对洁净区微生物的动态要求洁净级别悬浮粒子最大允许数/米3

Atrest/静态Inoperation/动态Grade≥0.5μm≥5.0μm≥0.5μm≥5.0μmA352020352020B352029

3520002900

C3520002900352000029000D352000029000不作规定Notdefined我国-WHO洁净级别标准级别b浮游菌CFU/m3沉降碟（90mm）CFU/4小时c接触碟（55mm）CFU/碟5指手套CFU/手套A1111B10555C1005025－D20010050－第45页，共69页，2023年，2月20日，星期四无菌产品洁净级别的确定A级：高风险操作区，如：无菌灌装区，灭菌后的内包装容器暴露的区域及无菌装配/连接操作的区域。通常用层流操作来维护该区的环境状态。层流系统在其工作区域必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。B级：指A级区所处的背景区域。C级和D级：指生产无菌产品过程中重要程度较次的辅助操作区，除菌前药液的配制，容器具处理、包装材料清洗等区域。第46页，共69页，2023年，2月20日，星期四悬浮粒子的要求：附录1<无菌药品>第九、十条1、A级区确认时的采样量不少于1m32、洁净区的动态监测悬浮粒子的动态监测关键操作的全过程，对A级区进行粒子监测A级区的监测频率、取样量，及时发现人为干预、偶发事件及任何系统的破坏B级区：类似于A级区，采样频率、采样量可以调整C级区：质量风险管理原则确定D级区：一般不作要求，（法规：必要时）对于C/D级区的自净时间应达到规定要求控制微生物污染途径—环境控制第47页，共69页，2023年，2月20日，星期四控制微生物污染途径—环境控制微生物的要求：附录1<无菌药品>第十一条监测方法有：1.空气浮游菌监测沉降菌法--被动法定量空气浮游菌采样法--主动法2.环境表面监测表面取样法（如棉签擦拭法和接触碟法）3.人员监测表面取样法（接触碟法）第48页，共69页，2023年，2月20日，星期四491.空气浮游菌监测沉降菌法--被动法沉降碟在空气中的暴露时间4小时监控整个灌装过程只能给出定性和半定量的数据应结合空气浮游菌的数据，对沉降碟的结果进行评价定量空气浮游菌采样法--主动法撞击式，离心式和膜过滤（明胶）取样仪应取一定体积的空气（取样体积应有代表性）仪器应经过校验2，洁净区的验证和监测第49页，共69页，2023年，2月20日，星期四502.环境表面监测：表面取样法应对接触产品表面、设备、地面、墙面等定期监测接触蝶法：适用于平整表面

取样面积25cm2

培养基略有凸起，高于碟子边缘，便于取样

培养基中应含有中和剂/保护剂棉签擦拭法：适用于不规则表面

取样面积~25cm2

定性或定量表面样应在无菌操作结束时取

以最大限度地降低无菌制造过程中关键表面污染的风险2，洁净区的验证和监测第50页，共69页，2023年，2月20日，星期四513.人员监测表面取样法（接触碟法），取样时间一般为：工作结束，离开洁净区前取样处理异常情况后（取样后重新更衣或更换手套）生产过程中随时监测特别注意：不得在刚消毒过后取样第51页，共69页，2023年，2月20日，星期四52每个手套(5只手指)胸口处衣帽结合处帽兜额头处靴子与工作裤接口处

前臂无菌区人员更衣确认和监测---手和操作服第52页，共69页，2023年，2月20日，星期四环境监控整体要求洁净区监测年度洁净级别确认日常环境监测动态监测静态监测无菌生产区A/B最终灭菌C级的主要功能间C级区域D级区域第53页，共69页，2023年，2月20日，星期四洁净区年度级别确认测试项目空气洁净度测试静压差测试风速或风量测试换气次数温度相对湿度照度噪声第54页，共69页，2023年，2月20日，星期四日常环境监测频次测试项目环境级别测试频次A级两周一次沉降菌/浮游菌C级一个月一次D级两个月A级/B级两周一次悬浮粒子C级一个月一次D级两个月A/C级每班生产结束手和操作服C级一个月一次D级三个月第55页，共69页，2023年，2月20日，星期四洁净区监测的位置取样位置选择时考虑因素：哪些部位的微生物污染最可能对产品质量造成不良影响？在生产过程中，什么地点最容易长菌？哪些地方是清洁、消毒或灭菌时最难覆盖/接触或最难奏效的部位？什么活动会导致污染的扩散？在某一部位的取样操作，足以导致测试数据的差错或污染产品？取样只应在生产结尾换班时进行吗？第56页，共69页，2023年，2月20日，星期四应符合“GB16292-2010”~“GB16294-2010”的要求基于风险的设计监测点设置在潜在风险最大的位置药品容器连接处人流和物流经过的地方监测点靠近“工作高度”洁净区监测的位置第57页，共69页，2023年，2月20日，星期四示例：无菌灌装线取样点应在产品或组件暴露的区域周围取样，如：在灌装针头处将产品装载入冻干腔室处胶塞供料桶无菌部件进行连接操作的部位操作人员频繁活动处（不影响生产过程）注意：靠近产品，但不接触产品的位置洁净区监测的位置第58页，共69页，2023年，2月20日，星期四粒子在线监测布置图例传感器低于机器，采样管伸入灌装操作区内灌装后冻干前监测点位置：药瓶是半封闭状态（敞口）保证灌装后，冻干前的环境区域是受控的。正确的取样点位置：靠近传送带。第59页，共69页，2023年，2月20日，星期四浮游