微生物的进化系统发育和分类鉴定

关于微生物的进化系统发育和分类鉴定第1页，共59页，2023年，2月20日，星期四目的要求：通过本章学习，要求学生掌握：1、进化指征的选择2、微生物分类学的基本知识

3、微生物的分类鉴定方法重点：

微生物的分类依据及方法。难点：代表原核微生物的拉丁学名和主要特点。

第2页，共59页，2023年，2月20日，星期四第一节微生物的进化和系统发育

微生物分类是按微生物的亲缘关系和相似程度把微生物归入各分类单元或分类群(taxon)，以得到一个反映微生物进化的自然分类系统、可供鉴定用的检索表以及可给出符合逻辑的名称的命名系统。所以微生物分类的具体任务就是分类（classification）、鉴定（identification）与命名（nomenclature）。

第3页，共59页，2023年，2月20日，星期四一、进化的测量指征1.合适的进化指征应满足的条件存在的普遍性序列的同源性序列的线性序列的保守性蛋白质、RNA和DNA序列进化变化的显著特点是进化速率相对恒定，也就是说，分子序列进化的改变量(氨基酸或核苷酸替换数或替换百分率)与分子进化的时间成正比。大量的资料表明：功能重要的大分子、或者大分子中功能重要的区域，比功能不重要的分子或分子区域进化变化速度低。第4页，共59页，2023年，2月20日，星期四16SrRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”或“分子计时器”：1）rRNA具有重要且恒定的生理功能；2）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；3）16SrRNA分子量大小适中(1540nt)，便于序列分析；4）rRNA在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)，也易于提取；5）16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)。因此它可以作为测量各类生物进化的工具。2.rRNA作为进化的指征缺陷：rRNA普遍高的保守性使得其在相近种、型分类鉴定时分辨力较差；操作相对较复杂。第5页，共59页，2023年，2月20日，星期四3.rRNA的顺序和进化培养微生物提取总的DNA作为模板rDNA序列测定分析比较微生物之间的系统发育关系PCR反应扩增16SrDNA片段第6页，共59页，2023年，2月20日，星期四4.基于rRNA的系统发育树系统发育树（phylogenetictree）：在研究生物进化和系统分类中，用以概括各种（类）生物之间亲缘关系的树状分枝的图形。分为有根树和无根树两种。一般系统发育树伍斯等根据某些代表生物16SrRNA(或18SrRNA)序列比较，首次提出了一个涵盖整个生命界的系统树。这是一颗有根树，rRNA序列分析表明，它最初先分成两支：一支发展成为今天的细菌(真细菌)；另一支是古生菌--真核生物分支，进化过程中进一步分叉分别发展成古生菌和真核生物。第7页，共59页，2023年，2月20日，星期四Eubacteria（真细菌界）Archaebacteria

（古细菌界）

Eukarya

（真核生物界）CarlWoese利用16SrRNA建立分子进化树第8页，共59页，2023年，2月20日，星期四进化树意义：将生物分为三界（细菌、古生菌、真核生物）随着资料的进一步积累，系统树还会做进一步修改生物间存在广泛的水平的或横向的基因交换基因的垂直传递不是影响生物进化的唯一过程CarlWoose的rRNA进化树完美无缺？第9页，共59页，2023年，2月20日，星期四界（Kingodm）门(phylum)

(亚门)

纲(Class)

(亚纲)目(order)(亚目)科(family)(亚科)族(group)(亚族)属(genus)(亚属)种(species)微生物分类的基本单位是“种”第二节微生物的分类单元和命名一、生物的分类单元第10页，共59页，2023年，2月20日，星期四种：分类特征高度相似、而又与同属内的其它种存在明显差异的菌株群。微生物的种具有如下特征:1.形态、生理特征相同。2.有共同的起源。3.是分类的基本单位，也是进化的单位。4.是繁殖的单位，同种才能产生后代，不同的种不能产生后代。5.种有遗传的稳定性，同时也存在变异性。6.目前，DNA同源性在70%以上，16srRNA同源性达97%以上的菌株定位一个种第11页，共59页，2023年，2月20日，星期四1、亚种（subspecies，subsp，ssp．）是种的进一步细分的单元，是正式分类单元中最低的分类等级。一般是指菌种在某一个特征上与模式种有明显而稳定的差异，但又不足以区分为新种。2、型（type）

是同一细菌种内显示很小生物化学与生物学差异的菌株，常用于细菌（尤其是致病菌）中紧密相关菌株的区分。

化学型(chemovar):产生某种化合物或其产量异常。致病型(pathovar):对一个或多个寄主的致病反应。噬菌体型(phayovar):对噬菌体的反应。血清型(serovar):抗原特性。

种以下的分类术语：第12页，共59页，2023年，2月20日，星期四4、菌株（strain）从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法（诱变等）所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。3、群（population)：在自然界中有些微生物的种类其特征介于两个种之间,彼此不易严格区分,于是我们就把这两个种和介于它们中间的一些微生物统称为一个“群”。第13页，共59页，2023年，2月20日，星期四8、克隆:是从单个亲本细胞得来的细胞群体。

6、培养物：指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。7、纯培养物：某一培养物是由单一微生物细胞繁殖产生的，就称为该微生物的纯培养物。5、标准菌株：又称模式菌株，通常是人们最先发现，并进行过描述具有典型特征的菌株。第14页，共59页，2023年，2月20日，星期四1新种的命名不应与已发表的真菌，藻类、原生动物同名。2.种名要用拉丁文,用双名法表示，新种要有典型菌株，新属要有典型种，并要同时发表菌种的保藏号。3.新种(属)要在“国际系统分类细菌学杂志”(IJSB)上发表。4.菌名的更改要得到仲裁委员会同意，并发表在IJSB上才能有效。

国际细菌命名法规

：二、微生物的命名第15页，共59页，2023年，2月20日，星期四双名法规定:一个生物的种名,由“属名+种名”构成，用斜体表示。原核微生物的学名，除了“属名+种名”外，还要在学名后面用正体写出最先定名的人名和时间(年代)。

StaphylococcusaureusRosenbach1884如果发现了一个原核生物，通过初步研究只知属于哪一个属，不知是何种时可用下列方式表示：属名+sp.(单数)或spp(复数)。

“双名法”种名用来描述颜色、形状、来源或科学家的名字。种名第一个字母小写。如：Escherichiacoli属名用来描述主要特征、构造或者科学家的名字。属名第一个字母要大写。第16页，共59页，2023年，2月20日，星期四新名称的发表Gilvimarinuschinensis

gen.nov.,sp.nov.

中国黄海菌

Wenxiniamarinagen.nov.,sp.nov以中国农业大学陈文新院士名字命名的新属Corynebacteriummarinumsp.nov.

海洋棒状杆菌第17页，共59页，2023年，2月20日，星期四第三节微生物在自然界的地位生物的界级分类学说：是在认识发展过程中存在的对生物分类的不同阶段的不同观点。如：二界系统、三界系统、四界系统、五界系统、六界系统和三原界系统。阴影部分为微生物第18页，共59页，2023年，2月20日，星期四五界系统真菌植物动物原生生物原核生物惠特克(Whittaker，1969)在前人分类研究的基础上提出了生物的五界系统。第19页，共59页，2023年，2月20日，星期四三原界系统Woese（1977）对16SrRNA核苷酸顺序的同源性进行测定后，1978年由R．H．Whittaker和L．Margulis提出了一个崭新的三原界（Urkingdom）学说。

所有生物存在一个共同祖先，由它分三条进化路线，就形成了三个原界：古细菌原界（Archaebacter）、真细菌原界、真核生物原界。该系统树表明古生菌和真核生物属“姊妹群”，它们之间的关系比它们与真细菌之间的关系更密切。三原界学说还吸收了关于真核生物是起源于原核细胞间的内共生即“内共生学说”的精髓，并使其内容更加完善了。系统地提出内共生学说者主要是Margulis。她在《真核细胞的起源》（1970）一书中，曾论述了真核细胞进化中的线粒体、叶绿体和鞭毛的共生起源。

第20页，共59页，2023年，2月20日，星期四第21页，共59页，2023年，2月20日，星期四古生菌真核生物真细菌三原界系统第22页，共59页，2023年，2月20日，星期四细菌的分类和伯杰氏手册原核生物分类系统纲要——伯杰氏系统细菌学手册真菌界分类系统很多，各国采用不同的系统，比较混乱。近年来为较多人接受的是Ainsworth的纲要。第23页，共59页，2023年，2月20日，星期四

关于细菌的分类系统，世界比较权威的细菌分类系统有三个：①、前苏联克拉西尼柯夫系统②、法国的普雷沃系统③、美国的伯杰氏系统一、细菌的分类系统第24页，共59页，2023年，2月20日，星期四《伯杰氏鉴定细菌学手册》美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)1957年第七版后，由于越来越广泛地吸收了国际上细菌分类学家参加编写(如1974年第八版，撰稿人多达130多位，涉及15个国家；现行版本撰稿人多达300多人，涉及近20个国家)，所以它的近代版本反映了出版年代细菌分类学的最新成果，因而逐渐确立了在国际上对细菌进行全面分类的权威地位。第25页，共59页，2023年，2月20日，星期四《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey’sManualofSystematicBacteriology)伯杰氏手册是目前进行细菌分类、鉴定的最重要依据，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。（20世纪80年代末期）《伯杰氏鉴定细菌学手册》(Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology)第26页，共59页，2023年，2月20日，星期四1、《伯杰氏系统细菌学手册》第一版（1984－1989）的分类《系统细菌学手册》第一版增加了一些核酸杂交、16SrRNA寡核苷酸序列等系统发育方面的资料。但总体上，细菌系统发育资料较零碎，未能按照界、门、纲、目、科、属、种系统分类体系进行安排，而是从实用需要出发，主要根据表型特征将整个原核生物分为33组，以4卷进行安排。第27页，共59页，2023年，2月20日，星期四

《伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)》将原核微生物分为35群，归纳为四大类(或四个门)：第一类，具细胞壁的革兰氏阴性真细菌；第二类，具细胞壁的革兰氏阳性真细菌；第三类，无细胞壁的真细菌；第四类，古细菌。2、《伯杰氏鉴定细菌学手册》(第九版)（1994）的分类第28页，共59页，2023年，2月20日，星期四《伯杰氏系统细菌学手册》第二版将原核生物分为古细菌和真细菌2个界，下设25门，39纲，89目，207科，包括852属，5000余种，分为五卷本出版。2、《伯杰氏系统细菌学手册》第二版（2001）第一卷，古菌、蓝细菌、绿色光合细菌和最先分化的属第二卷，变形细菌第三卷，低G＋C含量的革兰氏阳性细菌第四卷，高G＋C含量的革兰氏阳性细菌第五卷，浮霉状菌、螺旋体、丝杆菌、拟杆菌和梭杆菌第29页，共59页，2023年，2月20日，星期四第30页，共59页，2023年，2月20日，星期四第31页，共59页，2023年，2月20日，星期四第32页，共59页，2023年，2月20日，星期四第33页，共59页，2023年，2月20日，星期四第34页，共59页，2023年，2月20日，星期四Ainsworth系统真菌界黏菌门真菌门鞭毛菌亚门接合菌亚门子囊菌亚门担子菌亚门半知菌亚门二、真菌的分类系统第35页，共59页，2023年，2月20日，星期四安斯沃思(Ainsworth,1973)的分类系统：真菌界的门和亚门分类检索表1有原生质团或假原生质团………………粘菌门Mycomycota

1无原生质团或假原生质团，同化阶段为典型的菌丝体

………真菌门Eumycota

2有能动细胞(游动孢子或游动配子)，有性阶段产生典型的卵孢子…鞭毛菌亚门Mastigomycotina

2无能动细胞

3有有性阶段

4有性阶段产生接合孢子……接合菌亚门Zygomycotina

4有性阶段产生子囊孢子……子囊菌亚门Ascomycotina

4有性阶段产生担子孢子……担子菌亚门Basidiomycotina

3无有性阶段……半知菌亚门Deuteromycotina

第36页，共59页，2023年，2月20日，星期四Ainsworth系统各主要类群的特征类群是否有隔膜无性孢子形成有性孢子形成低等真菌鞭毛菌亚门无可运动的游动孢子合子、卵孢子接合菌亚门无非游动性的孢囊孢子接合孢子高等真菌子囊菌亚门有分生孢子子囊孢子担子菌亚门有罕见担孢子半知菌亚门有分生孢子无第37页，共59页，2023年，2月20日，星期四真菌词典（1995）第8版的分类体系：

真菌界（Fungi）

子囊菌门（Ascomycota）

担子菌门（Basidiomycetes）

担子菌纲（Basidiomycetes）

冬孢菌纲（Teliomycetes）

黑粉菌纲（Ustomycetes）

壶菌门（Chytridiomycetes）

接合菌门（Zygomycota）

毛菌纲（Trichomycetes）

接合菌纲（Zygomycetes）

第38页，共59页，2023年，2月20日，星期四第3节微生物的分类鉴定方法主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找权威性鉴定手册鉴定技术的不同水平：细胞的形态和习性：形态特征、运动、酶反应、营养要求及生长条件等细胞组分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、光合色素等的分析蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等基因或DNA水平：核酸分子杂交、（G+C）mol%、转化和转导、16SrRNA寡核苷酸序列分析、DNA或RNA核苷酸序列分析等第39页，共59页，2023年，2月20日，星期四一、传统分类法

根据微生物形态、生理生化、生态和抗原等表型特征进行分类的方法，这是微生物分类鉴定中通常采用的方法。

1、形态特征:(1)形状:球状、杆状、弧形、丝状、分枝及特殊形状(2)大小:菌体宽×长或者直径大小(3)排列:单个、成对、成链或其他的特殊排列方式(4)革兰染色反应:

G+、G—,G不定。(5)细胞内含物:聚β-羟基丁酸、异染粒、硫粒等。(6)鞭毛与运动性:有无鞭毛、鞭毛着生位置、菌体运动性第40页，共59页，2023年，2月20日，星期四(7)荚膜有无。(8)芽胞:有无、形状、着生位置、孢囊是否膨大(10)孢子:孢子形状、数量、排列(11)其他：a.蓝细菌的异形胞b.鞘细菌有鞘:c.柄细菌有柄:d.粘细菌形成子实体:(12)菌落特征：包括形状、大小、边缘、表面及质地、隆起程度、易挑取性或粘稠度、透明度与色泽等。

(13)液体培养特征：包括生长量、生长类型与分布、混浊度、表面生长状态、沉淀物、气味和颜色等。

第41页，共59页，2023年，2月20日，星期四2、生理生化特征营养类型：光能自养、光能异养、化能自养、化能异养氮源：蛋白质、蛋白胨、氨基酸、含氮无机盐、N2碳源：单糖、双糖、多糖、醇类、有机酸等生长因子：维生素、氨基酸、X-因子、V－因子等的依赖性需氧性：好氧、微好氧、厌氧、兼性厌氧温度：最低、最适及最高生长温度及致死温度对pH的适应性：pH生长范围对渗透压的适应性：对盐溶度的耐受性或嗜碱性对抗生素及抑菌剂的敏感性：代谢产物：有机酸、气体、酶类、色素、抗生素、毒素等与宿主的关系：共生、寄生、致病性等第42页，共59页，2023年，2月20日，星期四形态和生理生化特征是最常用的细菌分类、鉴定指标第43页，共59页，2023年，2月20日，星期四肠道菌科细菌属和种的分类鉴定第44页，共59页，2023年，2月20日，星期四二、血清学试验与噬菌体分型1.血清学试验原理：抗原---抗体特异性结合凝集反应、免疫荧光、ELISA快速、特异性强灵敏度高血清学分型在流行病的研究中有重要意义第45页，共59页，2023年，2月20日，星期四2.噬菌体分型原理：一种噬菌体只裂解某种特定的细菌第46页，共59页，2023年，2月20日，星期四四.核酸碱基组成和分子杂交1.DNA碱基组成DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数(G+Cmol%)来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。

(G+C)(mol)(G+C)％＝——————————×100％(A+T)十(G+C)(mol)第47页，共59页，2023年，2月20日，星期四同种不同菌株G+Cmol%差异应在4-5%以下。同属不同种的G+Cmol%差异应小于10-15%，通常小于10%原核微生物DNA(G+C)mol％为20—80。真核微生物DNA(G+C)mol％为30—60。

(G+C)％相同或相近的微生物并非必然亲缘关系密切，也就是说，并非一定就是相同或相近的种属。

(G+C)％值有明显差异的微生物肯定不会属于同一个种。

第48页，共59页，2023年，2月20日，星期四G+C%的测定方法:

A、化学测定法B、熔解温度(Tm)法

当DNA在一定温度下开始解链时，在260nm处吸收光谱明显增加，达到一定的温度后DNA全部解链，吸收光谱不再增加。

将25℃时DNA吸收光密度定为A25，测定不同解链温度的光密度定为At，以At／A25为纵坐标，加热温度为横坐标，作图,即可得出一条S形曲线,曲线的中点即为Tm值。

先用酶水解DNA，用纸层析分离核苷酸碱基，然后洗脱和定量单个碱基。Marmur的经验公式:(G+C)%=(Tm―69.3)×2.44

第49页，共59页，2023年，2月20日，星期四◆每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。第50页，共59页，2023年，2月20日，星期四2、核酸杂交