Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA

实验

0Y果蝇遗传标记分析-PAPD一、实验目的：

1.掌握RAPD分析基本方法技术; 2.了解分子标记的重要应用价值.二、主要内容：

基因DNA提取 PCR反应 电泳 电泳图谱的观察、分析助教：王家文Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第1页!（1）D.Virilis------------10只（2）黑腹果蝇—P、F1、F2（3）其他材料--0.2g1份（3种果蝇样品+2种其他）/小组果蝇用自己存的材料。材料：Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第2页!

1.提取粗DNA液现在先做（合理分工、协调时间）：每份材料（普通果蝇20只、大果蝇10只、或其他材料0.2g）+50μL匀浆缓冲液匀浆液体倒入1.5ml离心管+等V苯酚-氯仿（1:1）颠倒混匀30s,12000rpm，5分钟。助教把握时间！！+50μL10%SDS颠倒混匀20s，65度水浴30min加入200μL的匀浆液10000rpm，3min，转移上清。Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第3页!移上清于另一离心管，+等V苯酚-氯仿（1:1）颠倒混匀，13000rpm，5分钟。12000rpm，10min移上清于另一离心管，加入2倍体积的无水乙醇，静置10min。弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，10000rpm，3min弃上清，超净台吹干沉淀。加入20ul的无菌水，溶解沉淀，备用。注意：转移上清时记住上清的准确体积，另外转移时操作要小心，枪头从液面上层往下层缓慢的移动，不要带入其它杂质。Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第4页!三、实验原理:

RAPD:建立在PCR基础上的一种分子标记。 模板高温变性→足够低的温度下（通常为36℃）与随机引物（一般10个bp）退火→PCR→电泳 如果两个退火位点足够近（200-2000bp左右）、分别位于互补的DNA链上，可以通过PCR扩增出DNA片段。

引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第5页!3.RAPD反应1‘．在0.2mlPCR管中配制20μl反应体系

随机引物1μL

ddH2O6μL每组领取5份样品所需量各组等分5份

分别加5种样品的模板DNA各3μL包括dNTPMixture,Taq酶,10×PCRbufferPCRmixture10μL

Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第6页! 操作分工 技术问题 注意事项实验课老师助教指导：注意听实验报告（为果蝇系列实验的最后部分）：

1.简单体现RAPD的实验原理、解决的问题； 2.实验结果（照片）显示出来（信号弱的可用画模式图辅助体现），标出样品名称、差异条带等，进行分析。

Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第7页!利用10个碱基的一个或几个随机引物非定点地扩增DNA片段，一般一个引物可扩增6-12条DNA片段，利用凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行基因多态性研究。RAPD是一种能快速进行基因多态性研究的技术，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简便易行。RAPDY果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第8页!Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第9页!Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第10页!RFLPY果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第11页!“AFLP”续： 由于变异、进化，一种引物可以使某一品系的DNA片段复制（扩增），而不能使另一品系的DNA片段复制（扩增）。 电泳分离：同一引物扩增品系1品系2引物如：EcoRI和MseI相关引物Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第12页!短串联重复序列STRs(shorttendemrepeats,mini-satellites)STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是1bp-8bp的串联重复，重复次数n=15-60，已知8000多个，主要形式为：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，

(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n为多见。1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第13页!定义：不同个体间，基因组DNA某部位的单核苷酸的变异。1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记（singlenucleotidpolymorphismSNP）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。 可通过杂交、序列分析、电泳等检测。单核苷酸多态性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第14页!1,Neutralalteration:abasesubstitutionwithnoeffectontheaminoacidresidueencoded.2,Conservativechange:abasesubstitutionthatresultsinanalteredaminoacid,buthasminimaleffectonproteinstructureorfunction.3,Non-conservativealteration:leadingtoachangeintheencodedaminoacidresiduethathasdramaticeffectsonproteinstructureorfunction.TheFunctionalEffectsofcSNPsY果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第15页!（1）组织匀浆液（已经准备好）

： LiCl0.40mol·L-1

Tris·HCl0.20mol·L-1（pH9.0） EDTA2.5mmol·L-1 RNaseA100g·L-1（2）

SDS10%<wt/vol>（已经准备好）相关试剂(3)25xTAE(在15’离心时配制)500ml用于后边的电泳

Tris12.1g冰醋酸2.86mLNa2EDTA•2H2O1.86gddH2O定容到100mL(一人配置，全班公用，用时稀释)Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第16页!若位点2处碱基发生改变，则Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第17页!2’．在PCR热循环仪中进行如下反应：

94℃200s→94℃60s→36℃60s→72℃120s

40个循环

→72℃(300s--600s)4．电泳（后继课中*） 1.5%琼脂糖凝胶（用20mL的1×TAE溶解琼脂糖配制）电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并照相记录。*第12周“非中断杂交实验”的“扩菌、倒所有的平板”步骤后（可以由一个同学提前一会儿进行）Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第18页!补充知识（课后阅读）：RAPDRFLPAFLPSTRSNPY果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第19页!Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第20页!是英文RestrictionFregrmeatLengthPo1ymor—Phism的缩写，意思是“限制性片段长度多态性”。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。RFLPY果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第21页!RFLPY果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第22页!AFLP:AmplifiedFragmentLengthPolymorphism.AFLPtechnologybinesthepowerofRestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)withtheflexibilityandpowerofPCR.Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第23页!荧光标记全自动AFLP原理与方法Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第24页!可变数目串联重复序列VNTRs(variablenumbertandemrepeats)每个VNTR都含有10-15bp核心序列，VNTR与STR比较类似，但是重复顺序更长；多态性及分布方面不如STR，因而VNTR作为遗传标记只是一种过渡，目前已较少使用，但是，VNTR曾经对STR的基因定位运用起到推动作用。Y果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第25页!1，ThemostabundantDNAmarkerpresentinthehumangenome，about90%ofsequencesvariantsinhumanareSNP.ThereisoneSNPinevery1000basesleadstoanestimatethatanytwoindividualsdifferbyuptothreemillionSNPs.2，Afewhundredthousandarecurrentlyidentified,but17millionofSNPsoutof3billionareestimated.3,SNPsincodingregionsofgeneshavebeentermedcSNPs,about500,000ofcSNPsandanaverageofabout6pergene.

FrequencyofSNPinHumanGenomeY果蝇与其他物种遗传标记比较分析RA共27页，您现在浏览的是第26页!Majorchangesinproteinstructurecan