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-.z.--.--考试资料目录摘要1前言31材料和方法41.1材料及主要试剂41.2方法4引物设计4扩增目的片段4目的片段的别离和回收〔Takara回收试剂盒〕5酶切反响5连接反响6感受态细胞制备6连接产物的转化6试剂盒抽提质粒DNA6重组质粒的鉴定及测序6原核表达7SDS蛋白电泳82结果92.1野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列克隆92.2野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列分析102.3Serpin-2重组表达载体酶切鉴定142.4蛋白质表达与SDS分析152.5WesternBloting分析153讨论16参考文献:17致18附录1.19附录2.20家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-2的克隆、序列分析及表达及表达摘要本研究以家蚕中大造品种为材料,以其cDNA为模板克隆家桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin-2基因;采用大肠杆菌原核表达系统〔BL21〕进展家蚕Serpin-2基因的表达研究。主要结果如下:根据野蚕Serpin-2〔GenBank登录号:AF242200.1〕序列设计适宜的引物,采用PCR方法克隆了家蚕Serpin-2基因。序列分析说明,家蚕Serpin-2基因编码区长度为990bp,编码329个氨基酸,相对分子量约为43.75kDa,等电点约为4.67。与家蚕Serpin-2比较发现,两者基因序列相似度高达99.29%,氨基酸序列相似度高达98.93%,推测家蚕Serpin-2与野桑蚕Serpin-2基因起着一样或类似的作用。将家蚕大造Serpin-2基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),转化到大肠杆菌BL21中,经1mmol/LIPTG诱导蛋白质表达。SDS电泳分析结果说明,经IPTG诱导转化家蚕Serpin-2的BL21菌与对照BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带,相对分子量约44kDa,与预计的大小相符,证实家蚕Serpin-2在大肠杆菌中得到表达。家蚕Serpin-2基因的成功克隆和原核表达研究为从分子水平上解析Serpin在野桑蚕体内的功能打下了根底。关键词:家蚕;Serpin-2;基因克隆;原核表达Cloningandprokaryotice*pressionofSerpin-2geneofBomby*moriAbstractInthisstudy,thegeneofSerpininBomby*mori(Serpin-2)wasclonedbyPCRusingthewholebodycDNAsastemplates.E.coliprokaryotice*pressionsystemwasusedfore*pressionstudyofserpin-2gene.Themainresultsareasfollows:AccordingtothesequenceofBomby*mandarinaserpin-2gene,properprimerwasdesignedandSerpin-2geneofBomby*mori〔TheGenBankaccessionnumbers:AF242200.1〕wasclonedbyPCR.Accordingtosequenceanalysis,the990bpcodingregionofSerpin-2encoding329aminoacidresiduesresultsintheoreticalmolecularweightof43.75kDa,isoelectricpointof4.67.CompariedtotheSerpin-2geneofBomby*moriandBomby*mandarina,thegeneidentityandaminoacididentityreach98.7%,respectively.ItrevealsthatSerpin-2ofBomby*moriandBomby*mandarinamayplayasameorsimilarrole.TheSerpin-2genewasconstructedtotheprokaryotice*pressionvectorpET-28a〔+〕andthentransformedintoE.coliBL21(DE3).And1mmol/LIPTGwasusedtoinducethetargetproteintoe*press.SDSanalysisindicatedthattherewasaspecificbandwithrelativemolecularweightof44kDaonPAGEprofilesfortheBL21withSerpin-2inducedbyIPTG,compariedtothecontractBL21andBL21withemptypET-28a(+),whichconfirmedthattheSerpin-2genewassuccessfullye*pressed.Thesuccessfulcloningandprokaryotice*pressingresearchofSerpin-2geneinBomby*morihasestablishedthefoundationforanalyingthefuctionofSerpininBomby*mori.Keywords:Bomby*mandarina;Serpin-2;cloning;prokaryotice*pression前言丝氨酸蛋白酶抑制剂〔Serineproteaseinhibitor,Serpin〕是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年衍变而来的构造序列同源的蛋白酶抑制剂,是一种球状蛋白,并且各种Serpins大约有30%的序列同源性,疏水区同源性高达70%[2]。目前,大约已有500种Serpins在动物、微生物、病毒和植物中得到鉴定〔IrvingJA,etal.,2000〕。由350至500个氨基酸组成并且有着高度保守的三级构造[3]。该抑制剂已陆续在真核生物,细菌和病毒中得到鉴定,而其超家族很多成员也被鉴定存在于病毒、植物和动物细胞组织中,而这些成员中大多数都是从哺乳动物血浆中别离的,它们大多与凝血过程有关[4]。丝氨酸蛋白酶抑制剂通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸酶的活性而参与了许多根本的生命活动[3],已经被广泛应用于农业、医药和食品等行业,对昆虫的生命活动也至关重要。Serpin在昆虫的头部、精巢和卵巢中的含量也很丰富,甚至在丝腺,中肠中也有分布,并且在受到外界微生物刺激时Serpin在昆虫的血淋巴和脂肪体中大量表达〔TongYandKanostMR,2005;AratakeH,etal.,1990;ZouandJiang,2005〕。有报道证明,一些Serpins在血细胞的细胞质中表达,也有一些Serpins蛋白在细胞内产生作用,定位于细胞质或细胞质和细胞核之中〔TongYandKanostMR,2005;樊净,2003〕。近10年来,昆虫Serpin分子水平的研究进展很快,但与哺乳动物相比,其新基因的发现、基因构造分析、表达调控和基因功能的研究较少,对于有些基因的功能机制还不清楚,在鳞翅目野桑蚕中的研究则更少[6]。目前对家蚕serpin家族成员的研究主要集中在Serpin6〔刘衬丽,许雅香等〕、Serpin16〔董照明,赵萍等〕和Serpin4〔查宏贤,许雅香等〕。其中对Serpin2的研究主要在烟草天蛾,Tong和Kanost〔2002〕发现烟草天蛾serpin2A参与免疫反响,抑制多种血淋巴蛋白酶,如烟草天蛾Serpin2抑制了血液中酚氧化酶原的活化级联反响;使用革兰氏阴性菌和阳性菌刺激烟草天蛾后,Serpin2与血液中的HP1形成复合物;并且,Serpin2还同时与HP21以及另外两个未鉴定的蛋白酶形成复合物。Zou等〔2009〕将家蚕34条serpin进展了进化分析,发现家蚕Serpin2与烟草天蛾的Serpin2A有较高同源性。为此本课题拟对家蚕Serpin2基因作较详细有研究,主要集中在基因克隆,序列分析比对。为研究家蚕Serpin2蛋白的功能打下根底。本研究方案利用基因Bank获得了野桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂〔Serpin2〕基因序列、通过序列设计引物。利用PCR技术基因克隆技术扩增并克隆家蚕Serpin2基因。经基因测序,对序列进展分析和比对。从而到达研究目的。1.材料和方法1.1材料及主要试剂家蚕〔大造〕cDNA、宿主菌E.coliTG1菌种、BL21菌皆为苏州大学特种经济动物饲养实验室保存。克隆载体pUCm-T为Takara公司产品;原核表达载体pET-28a〔+〕由本实验室保存。PCR试剂盒〔内含Taq酶、dNTPmi*、10×buffer等〕、凝胶回收试剂盒、250bpDNAMarker、100bp-6000bpDNALadderMarker、限制性内切酶Hind3、BamH1和T4DNALigase为宝生物工程()产品;蛋白质Marker为Promega公司产品;小牛血清白蛋白为上海生工生物工程产品;质粒小量快速抽提试剂盒为上海申能博彩生物科技产品。NCBI的Blast工具;E*PASy在线ScanProsite程序〔.e*/tools/pi_tool.html〕;在线程序;DNAMAN软件;TanonGis凝胶图像处理系统。1.2方法1.2.1引物设计根据家蚕Serpin-2序列设计一对引物扩增野桑蚕Serpin-2基因的ORF区域。正向引物SPN2F:5’-CCCAAGCTTTCAATTTCGTCCACG-3’反向引物SPN2R:5’-CGCGGATCCATGGATTCAAAGGCT-3’1.2.2PCR扩增目的片段a.在离心管中,按照Takara公司Taq酶的使用说明进展如下操作:ddH2O35.5μL10×LAPCRBufferII(Mg2+Plus)5μLdNTP混合物(每种10mmol/L)4μLSerpin2F2μL(10μmol/L)Serpin2R2μL(10μmol/L)模板cDNA1μL〔约0.1~0.2μg〕La×Taq酶0.5μLTotalvolumn:50μLb.将含上述混合物的反响管放入PCR仪中,PCR反响体系的条件如下:94℃预变性2min94℃变性30sec48℃复性30sec33cycles72℃延伸1.5min72℃延伸10minc.PCR反响完成后,取5μL电泳鉴定。1.2.3目的片段的别离和回收〔Takara回收试剂盒〕〔1〕从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块。〔2〕将胶块放入1.5ml管中,将其适当切小,加速溶解。参加200μl胶块融化液DR-IBuffer。〔3〕均匀混合后75℃加热融化胶块。此时应连续振荡,使胶块充分融化。〔4〕向上述胶块融化液中参加DR-IIBuffer100μl〔1/2DR-IBuffer量〕,均匀混合。〔5〕将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。〔6〕将上述混合液转移至SpinColumn中,12000r/min离心1min,弃滤液。〔5〕将300μlRinseA参加SpinColumn中,12000r/min离心30s,弃废液。〔6〕将500μlRinseB参加SpinColumn中,12000r/min离心30s,弃废液。〔7〕重复步骤〔6〕。〔8〕将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上,在SpinColumn膜中央处参加25ul的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer,室温静置1min。〔9〕12000r/min离心1min洗脱DNA。1.2.4酶切反响在500μL的微离心管中依次参加ddH2O8μL,10×Kbuffer2μL,质粒8μL,限制性内切酶各1μL,组成20μL酶切体系,37℃水浴反响2h,取酶切产物8~10μL进展1.2%琼脂糖凝胶电泳,检测是否酶切完全,并拍照记录。1.2.5连接反响与pUCm-T载体连接〔10μL〕:在微离心管中依次参加PCR纯化产物7.5μL,载体pUCm-T0.5μL,T4DNALigasebuffer1μL,T4DNALigase1μL;16℃水浴反响12h。1.2.6感受态细胞制备用无菌铂丝直接醮取E.coliTG1菌株,在LB平板外表划线,37℃倒置培养过夜;从LB平板上挑取单菌落,接种于3mLLB液体培养基中,37℃震荡培养过夜;取30μL培养液接种于3mLLB液体培养基,37℃震荡培养2.5h,至肉眼能看到微微浑浊;将培养液转入1.5mlEppendorf管,冰浴10min;4℃、4000r/min×5min,弃上清;用预冷的75mmol/LCaCl2750μL轻轻悬浮细胞,冰浴30min;4℃、4000r/min×4min,弃上清;参加预冷的75mmol/LCaCl2〔内含甘油终浓度为15%〕200μL,轻轻悬浮,冰浴至少4h,即成感受态细胞悬液,分装后-70℃保存。1.2.7连接产物的转化取200μL感受态细胞悬液,参加连接溶液10μL,轻轻混匀,冰上放置30min;42℃水浴1.5min,冰上放置2.5min,参加1mL37℃预热的液体培养基,37℃预表达1h,使细胞恢复正常生长状态;4℃,3500r/min×5min,将菌液浓缩至200μL,分别参加10μL的IPTG和20μL*-gal,轻轻悬浮细胞,将菌液均匀涂布在含Amp+的LB固体培养基上,37℃正面放置30min,待菌液完全被培养基吸收后,37℃倒置培养过夜。1.2.8试剂盒抽提质粒DNA挑取转化后的白色单菌落,分别接种于3mL含适当Amp+抗生素的LB培养基,37℃下200r/min振荡培养过夜。之后按照质粒小量快速抽提试剂盒的说明书进展DNA抽提。1.2%琼脂糖凝胶电泳至质粒条带迁移至凝胶中部以后,仔细分辨迁移率的差异,选取迁移率较小的几管质粒DNA用于进一步鉴定。1.2.9重组质粒的鉴定及测序取上述迁移率较小的几管质粒DNA用酶切进展鉴定;取适量的酶切或PCR产物进展1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。;取电泳结果符合预期的样品送公司测序1.2.10原核表达如图1,构建pET-28a(+)-Serpin-2原核表达质粒。挑取转化有重组原核表达质粒的大肠杆菌BL21单菌落,在含卡那霉素的3mLLB液体培养基中37℃,200rpm振荡培养过夜;取30μL过夜培养菌于含有卡那霉素的3mLLB液体培养基中继续振荡培养;当OD600值约0.6时,加IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃,200r/min振荡培养6h。取1.5mL培养液于离心管中,10000g离心5min,弃上清;参加100μLTEbuffer〔pH8.0〕,悬浮菌液沉淀,参加100μL的2×样品缓冲液,煮沸5min,即可上样。LLac1oriKan+BamHⅠHindⅢpET-28a(+)Lac1oriKan+BamHⅠHindⅢpET-28a(+)重组质粒BamHⅠHindⅢKan+oriLac1pET-28a(+)-Serpin-2BamHⅠHindⅢSerpin-2图1Serpin-2基因原核表达载体的构建1.2.11SDS蛋白电泳安装好电泳槽,按表1配制4mL12%别离胶。迅速在两玻璃板间灌注别离胶,加一层去离子水。将凝胶垂直静置于室温30min。弃去别离胶上层去离子水,按表1制备2.5mL5%的浓缩胶,将配置好的浓缩胶快速灌注在两玻璃板上部,并在上面插入梳子,小心操作防止混入气泡;室温聚合30min,小心拔出梳子,在电泳槽中参加10×Tris甘氨酸电泳缓冲液,用注射器取10µLBL21菌液、空载质粒BL21菌液、表达样品上样,80V电泳;待溴酚蓝从浓缩胶进入别离胶界面时,将电压调至100V;待溴酚蓝接近凝胶底部时,停顿电泳;凝胶放入考马斯亮蓝染色液中染色10min,弃染色液加脱色液脱色10min,弃脱色液后再次加脱色液在摇床上低速摇动1~2h,直至背景清晰;最后拍照记录。表1SDS电泳的凝胶配制〔单位为mL〕12345678胶类型胶浓度去离子水Cry/BisBufferBufferAPSTEMED(30%)(pH8.8)(pH6.6)(10%)(10%)浓缩胶5%1.020.43-1.00.050.002别离胶12%1.1251.61.25-0.0250.002注:APS需现配现用,0.1g过硫酸铵+1mlH2O。2实验结果2.1家蚕Serpin-2基因的cDNA序列克隆以野桑蚕cDNA为模板,利用引物SPN2F和SPN2R进展PCR扩增反响,得到大约1100bp的条带(图2)。将目的条带连接T载体,利用原核克隆体系富集重组质粒后进展酶切验证。(图3)图2家蚕Serpin-2编码区克隆M:250bp分子量标准;1:Serpin-2编码区克隆图3Serpin-2编码区克隆重组质粒酶切鉴定M:6000bpDNALadderMaker;1:Hind3、BamH1双酶切的重组质粒2.2野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列分析通过软件得到家蚕与野桑蚕Serpin-2基因序列相似性直观分析图〔图4〕。图中重合局部为相似局部,从图中可知两者相似度极高。图4家蚕与野蚕的相似性分析为了进一步研究二者的相似性,本研究通过blast方法在genbank网站中进展两基因比照分析,发现基因在相似局部碱基重合度为98.7%〔图5〕图5野桑蚕和家蚕Serpin-2基因相似局部比照分析〔红色竖线表示碱基一样〕又如图6所示,测得的家蚕Serpin-2基因的ORF长度为987bp,编码329个氨基酸残基。其蛋白质预测分子量约为43.75kDa,等电点约为4.67。1020304050601ATGGATTCAAAGGCTTTATCCTCTGCAGTCACCAAGTTCTCTGCAAAGTTTTGCAATGAA1MDSKALSSAVTKFSAKFCNE70809010011012061CTGGATAAAAAGAAGAATGTTGTATCATCGCCATTGTCAGCAGAATACTTGCTGGCGTTG21LDKKKNVVSSPLSAEYLLAL130140150160170180121ATAACTTTGGGAACTACTGATCCTGCACACGAAGAGCTATTGACAAGCCTAGGTATCCCG41ITLGTTDPAHEELLTSLGIP190200210220230240181GATGATGACACGATTCGCTCATCATTCTCGGCTGTGTCGTCAAAATTGAAATCAATAAAA61DDDTIRSSFSAVSSKLKSIK250260270280290300241GGTGTTACGTTTAATGTAGCCAACGAAATATACATCAAGGAGGGTGACTATGAGCTCGAC81GVTFNVANEIYIKEGDYELD310320330340350360301CCAAAACTTAAGAAGGACGCTGTCGAGGTATTCGATGCAGATTTTGAAAAAGTTGACTTC101PKLKKDAVEVFDADFEKVDF370380390400410420361GATAACGGAGCCGCAGCCGCCGGCCTAATAAACAAATGGGTTGAAAATAAAACAAATGAA121DNGAAAAGLINKWVENKTNE430440450460470480421CGTATTAAAGATCTCTTGAGTGAAGACAGCCTCGATTCGTATACGCGTTTGGTTTTGGTC141RIKDLLSEDSLDSYTRLVLV490500510520530540481AACGCTCTCTACTTCAAGGGTACATGGCAAAACCAGTTCGACTCTATAAGCACCATGGAG161NALYFKGTWQNQFDSISTME550560570580590600541CGACCGTTCTATGTTGACACCGAAACGACAGTTAATATTCCTATGATGTACCAAGAAAAT181RPFYVDTETTVNIPMMYQEN610620630640650660601AATTTCAAGTATGGTGAGAGCCACGACCTCAATGCGCAGTTACTTGAAATGGCGTATGAA201NFKYGESHDLNAQLLEMAYE670680690700710720661GGTAACGATGCCAGCATGGTTATCGTGCTGCCGAACGAAATTAATGGCCTGGACGGGATA221GNDASMVIVLPNEINGLDGI730740750760770780721CTGCAGAAGCTGGCCGATGGCTACGACCTAACTTCGGAACTGGACAAAATGTTCTCGACC241LQKLADGYDLTSELDKMFST790800810820830840781AAAGTGCGAGTGACGGTGCCGAAATTCAAGATCGAAACTGAGATTGATCTACTTCAAGTT261KVRVTVPKFKIETEIDLLQV850860870880890900841TTGCCCAAGTTGGGTATTCAGGCGATCTTCAACCGCCAGAATTCCGGTCTGACCAAGATC281LPKLGIQAIFNRQNSGLTKI910920930940950960901TTGGATAACGACGAGCCGCTGTACGTATCCAAGGCTGTGCAAAAAGCCTTCATTGAAGTC301LDNDEPLYVSKAVQKAFIEV970980990100010101020961AACGAGGAAGGCGCCGAAGCAGCCGCCTGA321NEEGAEAAA*图6家蚕Serpin-2基因的cDNA核苷酸序列及推导的氨基酸序列*2.3Serpin-2重组表达载体酶切鉴定将PCR产物回收纯化后连接进pET-28a〔+〕原核表达载体;重组质粒经Hind3、BamH1双酶切鉴定,结果如图〔6〕。在约1.2kb大小位置出现了一条条带,与预期结果相一致。图6野桑蚕Serpin-2基因表达重组质粒酶切鉴定M.DNAmarker;1.带有目的片段的pET-28a载体酶切结果2.4serpin-2的蛋白质原核表达SDS分析家蚕Serpin-2重组转化菌经IPTG诱导表达后,SDS分析如图7所示,在40~50kDa大小位置诱导转化目的基因Serpin-2的BL21菌与对照组BL21(DE3)菌、空pET-28a(+)转化BL21(DE3)菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带(图7中箭头所指),而预测的野桑蚕Serpin-2蛋白分子量约为43.75kDa,与预期的所要表达的Serpin-2蛋白分子量大小相符,推测家蚕Serpin-2基因在大肠杆菌中得到成功表达。图7Serpin-2基因表达产物的SDS电泳和WesternBlot分析M.蛋白质Marker;1.无质粒转化的BL21菌的表达;2.空载体pET-28a转化BL21菌后的表达;3.经1mMIPTG诱导的pET-28a-Serpin-2的表达;3讨论家蚕(Bomby*moriL.)和野桑蚕(Bomby*mandarinaMoore)同属鳞翅目家蚕蛾科。研究证明,家蚕与野桑蚕的血缘十分亲近[7],根据野桑蚕Serpin-2序列设计引物,采用PCR方法成功克隆了家蚕Serpin-2基因。序列分析说明,家蚕Serpin-2基因编码区长度为987bp,编码329个氨基酸,相对分子量约为43.75kDa,等电点约为4.67。与家蚕Serpin-2比较发现,两者基因序列相似度达99.29%,有8个基因不同;氨基酸序列相似度达98.93%,4个氨基酸残基有差异。推测野桑蚕与家蚕Serpin-2起着一样或类似的作用。将野桑蚕Serpin-2基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,SDS电泳说明,野桑蚕Serpin-2在大肠杆菌中成功表达,蛋白相对分子量约44kDa,与推导的蛋白分子量相符。pET-28a〔+〕作为原核表达载体,它含有T7启动子,是一种T7噬菌体表达系统,具有能转录大肠杆菌RNA聚合酶不能有效转录基因的优点,而且其转录效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍,能够高效转录mRNA,大量表达目的蛋白。其多克隆位点上游有6个组氨酸和凝血酶位点,可利用固化Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白,还可以用凝血酶切割纯化的融合蛋白,从而获得重组的目的蛋白,是一种较好的表达载体。与真核表达系统相比,具有本钱低廉,操作简单,容易培养,生产周期短,易于获得高水平表达蛋白的优点[8]。本研究成功构建了含有Serpin-2基因完整ORF序列的原核表达载体,并且目的基因在原核大肠杆菌细胞中成功表达,为进一步对该表达产物的活性分析及相关功能研究提供了参考。目前,昆虫Serpin-2的功能特性尚无清晰的研究和认证,鉴于Serpin超家族成员的同源性较高,可以从研究该家族中其他成员着手,探索研究Serpin-2的生理功能。很多实验说明Serpin在昆虫中具有一定的免疫作用。它们与丝氨酸类蛋白酶形成非共价复合物,在局部发生黑化反响,阻止丝氨酸蛋白酶的级联反响,从而抑制多酚氧化酶原的激活,发挥它们的免疫功能[9]。经分析,该野桑蚕Serpin-2基因编码的氨基酸序列中不含信号肽序列。信号肽在蛋白分泌的过程中起重要作用,分泌性蛋白质合成后由信号肽引导其穿过合成所在的细胞到其他组织细胞中[10]。该研究中Serpin-2基因编码的氨基酸序列中不含信号肽序列说明它在细胞内起作用,这一点跟烟草天蛾Serpin-2有共同之处。烟草天蛾Serpin-2是一种细胞内蛋白质[11],在细菌刺激后,该基因在血细胞的细胞质中表达[12]。野桑蚕Serpin-2在细胞内的调控网络中如何发挥作用,其具体调节机制和功能还有待更进一步研究。参考文献[1]于继彬,季平,沈卫德.野桑蚕的遗传多样性及其研究进展(J).中国农业,2001,22(4):51-5[2]张梅,朱柞铭,1996.丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究及应用.生物化学与生物物理进展,23(3):240-244[3]樊静.丝氨酸蛋白酶抑制剂B家族(J).生命的化学,2003,23(4):275-276[4]CarrellRW,BowellDR,1986.Serpins:
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