酶工程习题习题与讲解

第五章酶工程习题答案一、填空题1.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是酶分子结构，二是2.Km是米氏常数。它与酶的种类和反应条件有关。反应条件。3..对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是致病菌，二是能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高，三是菌种不易退化，四是最好选用能产生胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。4.酶制剂有四种类型即液体酶制剂固体酶制剂纯酶制剂固定化酶制剂5.通常酶的固定化方法有吸附法，共价键结合法，交联法，包埋法。6.酶分子的体外化学修饰又可分为酶的表面修饰和内部修饰。经化学修饰的酶热稳定性有较大提高，这是因为修饰剂的多个功能基团与酶分子上的的多个基团（如氨基、羧基、咪唑基等）相互交联，增加了酶分子构象的稳定性。7.生物酶工程主要包括三个方面：基因工程方法大量生产酶（克隆酶）；对酶基因修饰产生遗传修饰酶（突变酶）；设计新的酶基因，合成新的酶。二、问答题1．解释下列名词：核酶：具有催化功能的RNA，包括剪切型核酶和剪接型核酶两类。克隆酶：通过基因工程手段，克隆各种天然的蛋白质或酶基因，并将其与适当的调节信号连接，再通过一定的载体（质粒）导入能够大量繁殖的微生物体内，使之高效表达。突变酶：利用有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或辅酶专一性，使之更加符合人们的需要。进化酶：创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随即突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。人工酶：又称模拟酶或酶模型，指利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。固定化酶：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。细胞固定化技术：将细胞限制或定位于特定空间位置的技术称为细胞固定化技术。它是酶固定化技术的延伸，亦为利用细胞内酶及酶系的捷径。细胞固定化主要适用于胞内酶。化学修饰酶：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质）（特别是具有生物相容性的物质）进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。通过这一方法获得的酶称为化学修饰酶。诱导酶：在正常细胞中没有或只有很少量存在，但在酶诱导的过程中，由于诱导物的作用而被大量合成的酶。抗体酶：结合了酶与抗体的特点，一方面起酶促催化作用，另一方面又起着抗体的选择性与专一性结合抗原的作用的酶称为抗体酶，又称催化性抗体。2．在生产实践中，对产酶菌有何要求？一般必须符合下列条件：（1）不应当是致病菌，在系统发育上最好是与病原菌无关；在食品和医药工业上应用时，菌种安全问题尤为重要。（2）能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高。（3）菌种不易变异退化，不易感染噬菌体。（4）最好选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。3.根据酶的合成与细胞生长的关系，可以把酶的生物合成模式分为哪几种？各有何特点？根据酶的合成与细胞生长的关系，可以把酶生物合成模式分为4种类型：同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。同步合成型：又称生长偶联型，是指酶合成与细胞生长同步进行，当细胞生长进入对数期时，酶也大量合成；当细胞进入稳定期时，酶的合成也停止。延续合成型：酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一段时间。中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入稳定期后，酶的合成也终止。滞后合成型：只有当细胞生长进入稳定期后才开始酶的合成并大量积累。图示如下：酶浓度AB细胞浓度度浓细胞浓度酶浓度CD细胞浓度酶浓度细胞浓度酶浓度时间(h)酶生物合成模式A.同步合成型;B.延续合成型;C.中期合成型;D.滞后合成型4.提高酶产量的措施有哪些？（1）添加诱导物。对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。诱导物一般可以分为3类——酶的作用底物、酶的催化反应产物和作用底物的类似物。（2）降低阻遏物浓度。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（如葡萄糖等容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。前者可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除，对于后者应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。（3）添加表面活性剂。表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。（4）添加产酶促进剂。产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。如添加一定量的植酸钙镁可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量大幅提高。5．固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？优点：（1）易将固定化酶和底物，产物分开产物溶液中没有酶的残留简化了提纯工艺（2）可以在较长的时间内连续使用（3）反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化（4）提高了酶的稳定性（5）较能适于多酶反应（6）酶的使用效率高产率高成本低缺点：（1）固定化时酶的活力有损失；（2）增加了酶生产的成本，工厂初始投资大；（3）比较适应于水溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；（4）与完整的细胞相比，不适于多酶反应，特别是不适宜于需要辅助因子的反应；（5）胞内酶必须经过酶的分离手续。6．酶固定化可采用哪几种方法？各有何优缺点？酶的固定化方法主要可分为载体结合法（又分为吸附法和共价键结合法）、包埋法和交联法等。其优缺点如下：固定化方法优点缺点固定化时酶分子的构象很少或基本结合力弱，易解吸附。吸附法不发生变化。制备过程中酶直接参与化学反应，常常引起酶蛋白质的结构发生变化，导致酶活力的下降，往往需要严格操作条件才能获得活力较高的固定化酶。酶和载体的连接键结合牢固，使用寿命长。共价结合法控制制备固定化酶的操作条件温和，不改变酶的结构，操作时保护剂及包埋法包埋的固定化酶只适用于小分子底物及小分子产物的转化反应，不适用于催化大分于底物或产物的反应。（凝胶法、微囊稳定性均不影响酶的包埋率。适用法）于多种酶、粗酶制剂、细胞器及细因扩散阻力将导致酶动力学行为改变而降低酶活性。胞的固定化。由于交联固定法化学反应比较激烈，固定酶的活力在多数情况下较脆弱，易失活。另外，这种方法所用的交联剂价格较贵，这就限制了该方法的广泛应用。交联法结合力强7．天然酶经固定化后，其酶性质与酶活力有何变化？为什么？（1）酶活力下降。原因：活性中心重要氨基酸与载体结合；酶的空间结构变化；酶与底物结合时产生空间位阻效应；包埋法制备的固定化酶活力下降的原因还有底物和产物扩散阻力增大。（2）酶稳定性明显增加。原因：蛋白酶固定化后，限制了酶分子之间相互作用，阻止了其自溶；其它酶固定化后可能增加酶构型牢固程度，阻碍了不利因素的侵袭；如果固定化过程影响到酶活性中心及酶的高级结构敏感区域，亦可能引起酶活性降低。（3）底物专一性有所改变。原因：位阻效应（4）最适pH改变情况不一。原因：酶蛋白及载体带电性质决定。若带负电荷载体使固定化酶最适pH向碱侧移，带正电荷载体使固定化酶最适pH向酸侧移，中性荷载体通常不改变侧移固定化酶最适pH。（5）最适温度一般均升高。原因：酶固定化后可能导致其空间结构更为稳定。（6）米氏常数（Km）发生变化。原因：酶固定化后酶和底物亲和力变化。当底物为大分子时，若酶采用包埋法固定化，则Km增幅极大；若底物为小分子时，Km值变化甚微；用离子吸附法制备的固定化酶，其Km值的变化原因主要是载体与底物间静电作用结果。8．根据酶的不同性质举出3种以上分离纯化的方法，并简述各种方法的主要依据。酶分离纯化常用透析、超过滤、离心、凝胶过滤、盐析、等电点沉淀法、吸附法、离子交换吸附法、亲和层析、热变性等方法。分离纯化方法主要依据透析法是利用半透性膜特性，将待纯化酶溶液（或其他大分子物质蛋白质）装入透透析法析袋中，沉浸于缓冲液或蒸馏水中；小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中。利用压力或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，将所需的酶分子被滤膜截超过滤法离心法留，而其它较小的分子随溶剂被压到膜的另一侧。借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，凝胶过滤法吸附法经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。利用样品中不同分子与吸附剂之间的吸附和解吸性质不同而达到分离的目的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失，同时蛋白质表面的电荷大量被中和，从而导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分盐析法离出来。等电点沉淀法酶在等电点处容易发生沉淀，从而与等电点不同的杂蛋白分离。利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。离子交换吸附法将亲和吸附剂（核心是亲和吸附剂，它是由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的亲和层析法配体共价结合而成）填充层析柱，让酶液流过层析柱，则目的酶能迅速而选择性地吸附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进行洗涤，除去一些非专一性的杂蛋白后，再用浓度高的或亲和力更强的配体溶液进行亲和洗脱目的酶便可被洗脱出来。根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。热变性法9．某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据，试计算比活力，回收率及纯化倍数。体积（ml）活力单位（u/ml）蛋白氮（mg/ml）初提取液12052008102.51.5硫酸铵沉淀（1）起始总活力：200120＝24000（单位）（2）起始比活力：2002.5＝80（单位/毫克蛋白氮）（3）纯化后总活力8105＝4050（单位）（4）纯化后比活力8101.5＝540（单位/毫克蛋白氮）（5）产率（百分产量）：405024000＝17％（6）纯化倍数：54080=6.7510.在一抽提液中含有三种酶，其性质如下：酶A相对分子质量20000等电点8.5B210005.96.0C5000试设计一个方案来分离纯化这三种酶。（1）将抽提液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而酶A、B、C被截留在透析袋中。（2）先分离酶C：利用凝胶过滤法，选择合适型号的凝胶介质填充在层析待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，大于凝胶孔径的分子(酶A和酶B)不能进入胶粒内部而从胶快，而小于凝胶孔径的分子（酶C）进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先柱中流出。柱中，平衡后加入粒间空隙扩展，下移速度较大后小的顺序从层析（3）分离酶A和酶B：等电点沉淀法利用酶在等电点时溶解度最低而各种酶又具有不同等电点的特别进行分离酶。利用酶A和酶B的等电点的相差，通过改变提取液的pH值使酶A或酶B溶液中沉淀出来而分离。分离酶A和酶B亦可采用离子交换吸附或者电泳法，将带不同电荷的酶A和酶B分离开。11.试述酶分子的体外定向进化基本原理、主要操作步骤与与常用方法。基本原理：酶的体外定向化属于蛋白质的非合理设计。从一个或多个已经存在的亲本酶出发，人为的创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随即突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。即：定向进化=随机突变+正向重组+选择主要操作步骤：确定作为起点的酶和基因（目标酶的活性和性质）↑↓用最好的突变体作为下一轮进化的起点↑选突变方法并建库↓分离并表征最好的突变体←建立选择或筛选方法（产物/检验/信号）常用方法：易错PCR；DNA改组等。12．请简述酶工程的2项具体应用并讲述其机理。溶菌酶溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌