第5章荧光光谱

第5章荧光光谱5.1基本原理5.2荧光探测5.3荧光光谱法的应用5.1基本原理荧光属于光致发光包括吸取和放射两个过程荧光光谱属于放射光谱光致发光可以在紫外-可见光区、X射线区等我们将关注紫外-可见光区，常用于有机化合物分析5.1.1荧光发光原理光致发光的能级向下跃迁过程无辐射跃迁：激发态→第一电子激发态的最低能级在激发态因碰撞以热的形式损失能量，跃迁到第一电子激发态的最低能级荧光放射：第一电子激发态的最低能级→基态能级由第一电子激发态的最低能级跃迁至基态，光的形式释放能量，即荧光磷光放射：三重态→基态能级先无辐射跃迁至三重态，逗留较长时间后再跃迁至基态能级，放射磷光荧光与磷光的区分从激发态跃迁到基态的路径不同从激发到发光的时间不同，荧光10-9~10-7s

磷光10-3~10s(三重态是亚稳态)

发光波长不同，荧光波长比磷光波长短5.1.2荧光光谱与吸取光谱形态波长谱带数荧光光谱与吸取光谱的比较荧光光谱灵敏度高，检测限可达ppb量级（10-9）荧光光谱选择性好，能吸取光的物质不确定能放射荧光，确定波长下不同物质的荧光光谱不同荧光光谱没有吸取光谱运用广泛，很多物质不产生荧光，并且荧光对环境因素特别敏感5.1.3产生荧光的基本条件入射光要能被物质粒子吸取，使粒子能够跃迁到激发态，然后经第一电子激发态的最低能级，着陆到基态振动能级物质粒子要具有高的荧光效率荧光过程速率常数，由物质粒子本身确定物质分子结构与荧光效率具有大共轭双键的分子简洁放射荧光，π→π*跃迁的量子效率高，寿命短（10-9~10-7s）共轭效应越大，荧光效率越高，苯<萘<蒽苯萘蒽物质分子结构与荧光效率（Cont.）

刚性平面分子荧光效率更高，会减小分子振动，从而减小与其它分子碰撞的可能，芴≈1.0>联苯0.18芴联苯取代基也会影响荧光效率给电子基(-NH2,OH)会增加荧光效率（共轭作用）吸电子基(-NO2,-C=O,-C=NH)会减弱甚至猝灭荧光取代基的空间阻碍作用会减弱荧光5.1.4影响荧光光谱的因素（外部）入射光强，荧光强度与入射光强成正比溶剂，一般溶剂效应，折射率和介电常数的影响特殊溶剂效应，物质分子与溶剂的化学作用增大溶剂极性，向长波移动，荧光强度增加温度，上升温度→物质粒子碰撞增多→减弱荧光pH值，荧光物质本身弱碱或弱酸性时影响较大内滤光，溶液中存在能吸取荧光的物质，减弱荧光自吸取，溶液浓度较大时，部分荧光会被物质本身吸取吸取光谱与荧光强度（激发的选择？）波长强度吸收光谱波长强度荧光光谱吸取强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下跃迁产生的荧光越强5.2荧光探测5.2.1荧光探测装置吸取光谱荧光光谱两点区分：在入射光的垂直方向探测探测器前还有一个单色器F-4500荧光光度计光路图（日立）5.2.2荧光团很多物质不会放射荧光或荧光效率低须要利用强荧光放射的荧光团（或荧光探针分子）荧光探针分子需满足两个条件：(1)能与待测物质某个微区专一而坚固的结合(2)这种结合不会破坏物质分子的结构和空间构象一些典型的荧光团色氨酸348nm4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚461nm

增加型绿色荧光蛋白509nm四甲基罗丹明576nm染料667nm

染料cy3的吸取、放射光谱最大激发波长550nm最大放射波长570nm(黄绿光)绿色荧光蛋白（GFP）

GFP荧光是生物细胞的自主功能，GFP是一种广泛应用的活体报告蛋白5.2.3荧光探测方法同步荧光光谱技术(1)在同时扫描激发单色器和放射单色器波长的状况下测量荧光光强，由测得的荧光强度对放射或激发波长作图(2)两种同步扫描形式——固定波长和固定能量(3)固定波长：激发波长与放射波长间隔固定(4)固定能量：激发光波光子能量与放射光波光子能量差固定(5)特点：①与激发光谱及放射光谱都有关系，能使选择性进一步改善②能够增加强带而减小弱带的干扰③它可以消退瑞利散射信号的干扰，也能够使拉曼强度降低，但同时会把拉曼吸取峰拉宽(6)波长间隔的选择特别重要！利用同步荧光光谱分别色氨酸1、酪氨酸2和苯丙氨酸3的重叠荧光峰一般荧光光谱同步荧光光谱(波长差70nm)时间辨别荧光光谱技术(1)时间辨别荧光技术用于测量荧光发光过程（很短的衰减过程）(2)用短脉冲信号激发荧光，取样积分探测随时间变更的荧光强度(3)时间辨别荧光技术可以对放射光谱重叠但寿命有差异的组分进行测定，也可以测量荧光衰减曲线及寿命相位辨别荧光光谱技术(1)也可以用于测量荧光寿命(2)基本原理：用正弦（或余弦）方式调制激发光光强，这样放射光强也会被正弦（或余弦）调制，由于吸取和放射之间的时间延迟，所以放射光的调制信号相比于激发光存在相位延迟，测量该相位延迟就可以得到荧光寿命(3)相辨别荧光技术是一种稳态测量技术，相比于时间辨别荧光技术，其灵敏度更高。5.3荧光光谱法的应用5.3.1元素分析（无机离子）能放射荧光的无机离子很少，一般不能干脆测量无机离子的荧光分析法：干脆法、荧光猝灭法、催化荧光法干脆法：无机离子与有机荧光试剂形成能发荧光的络合物，干脆测量络合物放射的荧光强度，很多元素可用该法，过渡金属离子除外荧光猝灭法：无机离子本身不能形成荧光络合物，但可从金属-有机荧光试剂络合物中夺取金属或有机试剂，形成更稳定的络合物，使金属-有机荧光试剂络合物的荧光强度降低，比如：S,Fe,Co,Ag,Ni催化荧光法：某些无机离子形成荧光络合物的速度很慢或荧光微弱而难于测定，但在微量金属离子催化下可使反应快速进行，这时可由给定时间内测定的荧光强度来测量该金属离子浓度常用有机荧光试剂待测离子荧光试剂吸收波长荧光发射波长Al3+，Fe-茜素紫酱R470nm500nmB4O22-苯偶姻370nm450nmSn4+黄烷醇400nm470nmLi+8-羟基喹啉370nm580nm5.3.2有机物分析脂肪族有机化合物具有高度共轭体系的或脂环化合物能放射荧光，维生素A、萝卜素结构简洁的脂肪族化合物本身能放射荧光的不多，需与有机试剂形成荧光化合物，可参考讲义中“荧光分析法测定丙三醇”的例子芳香族化合物具有共轭不饱和体系结构，易于吸光，其中分子浩大而结构困难的化合物在紫外光辐射下能产生荧光荧光较弱的芳香族化合物可与有机试剂反应获得荧光较强的物质蛋白质：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）荧光强弱：Trp>Tyr>Phe激发和放射波长：Trp>Tyr>Phe色氨酸和酪氨酸的荧光最大放射波长分别为348和302nm荧光峰存在重叠，可利用同步荧光光谱分别，Δλ<15nm的同步荧光光谱为酪氨酸的特征，Δλ>60nm的同步荧光光谱为色氨酸的特征5.3.3定量分析

定量分析基础荧光与吸取光强：朗伯-比尔定律：}稀溶液近似分析方法可借用紫外-可见光谱法中的干脆比较法、标准曲线法、差示法等课堂练习1．氧气在760nm旁边的吸取截面约为10-27cm2，假设在一个光程为1m的气体容器中充入氧气，测得吸光度为0.