免疫细胞化学实验技能总结

关于免疫细胞化学实验技能总结第1页，共78页，2023年，2月20日，星期三1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。第2页，共78页，2023年，2月20日，星期三2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理,组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。第3页，共78页，2023年，2月20日，星期三常用的标记物有荧光素、酶和放射性同位素：标记荧光素的称为免疫荧光法，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。标记酶的称为免疫酶法，常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)等。标记同位素的称为放射免疫法，常用的同位素有3H、14C、32S和31P等。第4页，共78页，2023年，2月20日，星期三

二、免疫酶/免疫荧光三、酶联免疫吸附试验一、石蜡切片/冰冻切片讲解提纲第5页，共78页，2023年，2月20日，星期三（1）石蜡切片的制作

蒸馏水洗涤2遍二甲苯约20min、二甲苯/石蜡(1:1)30min,纯蜡Ⅰ、Ⅱ各30min常规石蜡切片，切片厚度为7µm50％、70％、80％酒精各15min，95％酒精Ⅰ、Ⅱ各15min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各15min，无水乙醇/二甲苯(1:1)15min于干净载玻片上进行展片，37℃烤干取材、固定酒精脱水洗涤展片、烤片包埋、切片透明、浸蜡第6页，共78页，2023年，2月20日，星期三根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。所采集材料应立即放入固定液，并编号，注明采集时间、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。如：角膜、TE-HC等组织材料细胞材料肝脏、鱼卵取材第7页，共78页，2023年，2月20日，星期三

取材后，应立即进行固定。固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。固定的意义新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后，应立即采用一种方法．将组织尽可能保持原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固定。固定第8页，共78页，2023年，2月20日，星期三固定的目的和作用在于：①防止组织自溶和腐败；②使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；③因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别，使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色；④固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。

第9页，共78页，2023年，2月20日，星期三名称10%甲醛4%多聚甲醛苦味酸冰醋酸锇酸固定效果好好沉淀一切蛋白对染色质固定好好组织收缩大小大小小主要用途常规病理切片免疫化学不单独使用不单独使用---核型电镜缺点长期用其固定的组织变为酸性不利于染色，特别是细胞核的着色固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜渗透力弱，对组织收缩大使组织膨胀，一般不单独使用价格昂贵；有毒第10页，共78页，2023年，2月20日，星期三混合固定剂（1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快，组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度，对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色。（2）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。（3）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好，固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定时间较长对组织亦无损害。第11页，共78页，2023年，2月20日，星期三固定时应注意的事项（1）固定液及被固定的组织必须新鲜；（2）固定液的用量一般为组织体积的10~20倍，容器不要过小，材料也不要太多；应避免组织紧贴瓶底或瓶壁，以免影响固定液的渗入；（3）固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的种类、性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实验目的等；（4）固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失效；（5）在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入，对长期固定的标本，可经常更换固定液;（6）取材固定应同时作好记录，包括组织名称、固定液和时间等内容。第12页，共78页，2023年，2月20日，星期三乙醇：高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点，因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水，而必须经过由低到高的一系列不同浓度的酒精，逐渐取代组织中水分，以保证组织脱水彻底，并避免组织过度收缩和硬化。脱水第13页，共78页，2023年，2月20日，星期三注意事项：

（1）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。（2）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组织块的过度硬化，使得切片病理组织易碎裂。（3）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80%的酒精中。（4）每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。第14页，共78页，2023年，2月20日，星期三置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用；二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；其最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对粘膜有刺激作用。透明第15页，共78页，2023年，2月20日，星期三（1）浸蜡的目的

置换组织中的透明剂，为包埋做准备。（2）注意事项

温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能超过60℃；浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。浸蜡第16页，共78页，2023年，2月20日，星期三（1）步骤

①准备包埋蜡：一般应用硬蜡（56~58℃或60~62℃），所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性。包埋用过的石蜡可以反复使用。②准备包埋框：可以用金属的，也可以用硬纸摺叠。③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签。④在包埋框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。⑤包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其凝固。⑥待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架，或拆开纸盒，取出蜡块。包埋第17页，共78页，2023年，2月20日，星期三（2）注意事项

①包埋时夹取组织的镊子，用酒精灯随时烧热，以免石蜡凝结后粘附在镊子上，造成蜡块凝固不均匀。②包埋操作要迅速，组织从浸蜡杯中取出置入包埋框中的时间应尽量缩短。③包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状，一般出现在组织周围或组织的底部，应考虑这样几个方面的问题：a.脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了，组织进行包埋时，包埋框中的蜡已成凝结状。c.组织内还残留有较多的透明剂。d.石蜡不纯。

④包埋箱中的温度必须保持恒定。⑤如包埋得不好，可将蜡块溶化，重新浸蜡和包埋。⑥较小的组织可在脱水透明时开始用伊红染色第18页，共78页，2023年，2月20日，星期三

包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。

切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。切片第19页，共78页，2023年，2月20日，星期三

用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是甘油蛋白。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层甘油蛋白，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。展片第20页，共78页，2023年，2月20日，星期三缺点：材料发生裂隙破碎或脱落原因：1．脱水不干净2．有透明剂残留3．石蜡透入时，温度过高或时间过长4．由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆5．材料太硬或太粗补救办法：1．无法弥补2．增加浸蜡时间，重新包埋3．无法补救4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明5．在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液常见问题分析第21页，共78页，2023年，2月20日，星期三缺点：石蜡带弯曲不直原因：1．石蜡块上下两边不平行2．石蜡块的上下两边不和刀口平行3．刀口锋利不一，局部产生差异4．蜡块的一边较另一边为软或两边的硬度不一致5．材料未居蜡块正中央6．材料大而形不正补救办法：1．取下台木，将两边修干2．调节标本台，使两者平行3．移动刀片，改用新的刀口4．待蜡块冷却后再切，或重新包埋5．用刀片切去部分石蜡，使材料居中6．在大的一边切去少许石蜡第22页，共78页，2023年，2月20日，星期三缺点：切片分离、不能连成带状原因：1．室温过低2．石蜡过硬3．材料边缘留蜡太少4．刀的角度不适合补救办法：1．在切片机上方开一电灯或提高室温2．在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面3．重新包埋4．矫正刀的角度第23页，共78页，2023年，2月20日，星期三缺点：切片卷起呈圆筒状原因：1．室温过低2．石蜡过硬3．刀口太钝4．刀的倾角太大补救办法：1．提高室温2．加软蜡3用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3片即成带4．减小倾角第24页，共78页，2023年，2月20日，星期三缺点：切片粘附于切片刀，皱摺在一起原因：1．室温过高2．石蜡过软3．刀口上留有一层石蜡4．刀口钝补救办法：1．降低室温2．将蜡块投入凉水中稍浸3．切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡4．磨刀或移动刀口第25页，共78页，2023年，2月20日，星期三缺点：石蜡块将蜡带抬起原因：1．由于摩擦而产生静电荷所致2．石蜡块上面附有石蜡碎屑3．刀口上附有石蜡碎屑补救办法：1．提高室温2．用刀片将碎屑清除3．用二甲苯或氧仿清除第26页，共78页，2023年，2月20日，星期三（2）冰冻切片的制作取材冰冻切片机切片冰冻胶固定展片第27页，共78页，2023年，2月20日，星期三(一）优点：

1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。

2．快速，用时短。

3．组织变化不大。

4．能很好保存脂肪，类脂等成分。

5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。第28页，共78页，2023年，2月20日，星期三

（二）缺点：

1．不容易做连续切片。

2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。

3．不容易制作较薄的切片。

4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。第29页，共78页，2023年，2月20日，星期三石蜡切片和冰冻切片的比较名称石蜡切片冰冻切片操作步骤繁琐简单抗原活性可能会破坏组织的抗原性完好地保存各种抗原活性及酶类切片厚薄薄厚优点薄，观察结构清晰；连续切片抗原活性好，适合免疫组化；简便操作缺点做免疫组化时部分需抗原修复不能连续切片；不能较薄切片第30页，共78页，2023年，2月20日，星期三细胞通透脱蜡、复水封闭抗原修复封片、镜检二抗孵育一抗孵育浸洗浸洗DAB显色（3）免疫酶法第31页，共78页，2023年，2月20日，星期三脱蜡和复水：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。第32页，共78页，2023年，2月20日，星期三抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。第33页，共78页，2023年，2月20日，星期三细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。第34页，共78页，2023年，2月20日，星期三血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温30min。但也要防止封闭过度。第35页，共78页，2023年，2月20日，星期三一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4度最佳，反应温和，但时间最好不超过16~24h。第36页，共78页，2023年，2月20日，星期三切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。②温柔浸洗，防止切片的脱落。③冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。④PBS的pH和离子强度的使用和要求。建议pH在7.4-7.6浓度为0.01M。（中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）第37页，共78页，2023年，2月20日，星期三DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色背景，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。第38页，共78页，2023年，2月20日，星期三产生组织切片非特异性染色1、抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。2、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3、血清封闭时间不够，这需要通过延长动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；4、DAB孵育时间过长或浓度过高；5、PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗孵育后的浸洗尤为重要；6、标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

常见问题分析第39页，共78页，2023年，2月20日，星期三染色后切片着色呈阴性结果1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；3、血清封闭时间过长。4、DAB孵育时间过短。5、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。6、组织切片本身这种抗原含量低；7、开始做免疫组化，建议一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。第40页，共78页，2023年，2月20日，星期三（4）免疫荧光固定、复水封闭二抗孵育一抗孵育封片、镜检浸洗浸洗细胞通透固定、复水封闭封片、镜检二抗孵育一抗孵育浸洗浸洗第41页，共78页，2023年，2月20日，星期三组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮/甲醇等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片保持避光和湿度。应在暗室中进行检查；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油。第42页，共78页，2023年，2月20日，星期三NIKON荧光显微镜操作规程使用须知操作流程注意事项第43页，共78页，2023年，2月20日，星期三使用须知1. 在记录本上登记“日期”、“使用人”、“实验内容”，检查使用记录中的上次汞灯关闭时间，确保汞灯关闭后至少40min才能再次开启使用。2. 进入显微镜室后首先记录显微镜汞灯指数，检查汞灯指数和上次汞灯使用记录是否一致，若不一致请联系仪器负责人。记录汞灯实际开启时间后方可进行实验操作，使用结束后记录汞灯实际关闭时间并再次记录汞灯指数，完成使用记录后归还钥匙和记录本。汞灯开启时间不得超过2h。3. 使用过程中，显微镜后部的照明灯箱可产生高温，请勿在亮灯或熄灯40min内触摸灯箱，也不要在灯箱周围放置纤维织品、纸张或易燃物质如酒精、二甲苯等。取下的防尘罩收入抽屉内，一定不要搭在灯箱上。第44页，共78页，2023年，2月20日，星期三操作流程—NIKON倒置荧光显微镜1. 取下防尘罩，确认荧光控制阀旋在关闭位置（C），打开汞灯电源（使汞灯预热），绿色指示灯亮。2. 打开显微镜电源，绿色指示灯亮。依次计算机电源，CCD电源。打开卤灯开关（白色按钮），旋转亮度调控手轮调亮视野。将标本置于载物台中间，旋转选择4×物镜，调节焦距至清晰度最佳。依次旋转10倍、20倍、40

倍物镜来选择所需的高倍物镜，每次调焦幅度要轻，以免损伤镜头（换用高倍物镜后只允许使用细调焦手轮）。125634第45页，共78页，2023年，2月20日，星期三操作流程4. 将卤光强度调到最小后关闭卤灯开关，荧光控制阀旋到开启位置（O）。确保汞灯电源开启3~5min后按下汞灯激发按钮，手动旋转激发方式转换盘选择相应滤片（G、B、UV）。5. 使用完毕，将荧光光闸旋到关闭位置（C），依次关闭汞灯电源、CCD电源、卤灯电源、显微镜电源和计算机电源，顺时针转动粗调焦手轮使物镜缓慢降至最低位，旋转物镜转换器使无镜头筒冲上。6. 关闭电源40min待灯箱变凉后，盖上防尘罩。125634第46页，共78页，2023年，2月20日，星期三注意事项1. 在调节焦距时一定要在4×物镜下进行调节，然后再换成高倍镜使用细调焦手轮进行小幅调动，直接在高倍镜下直接调焦可能会造成物镜镜头接触到标本，损伤到镜头。2. 在低倍物镜换用高倍物镜时，不要用手指直接转动物镜，应手握转换器上层的转动板来转换物镜，否则可能会使物镜的光轴发生偏斜。且由于转换器材料质地软、精度高，螺纹受力不均匀便容易松脱，螺纹损坏可能导致整个转换器的报废。第47页，共78页，2023年，2月20日，星期三注意事项4.以上操作规程未涉及到的旋钮、滤片等其他部件，切勿随意按动。5.请不要随意改动拍摄软件的基本设置（曝光时间除外），若要改动，请告知仪器负责人；显微镜使用完毕后将显微镜载物台和桌面上的杂物清理干净，待汞灯变凉后盖上防尘罩。第48页，共78页，2023年，2月20日，星期三使用荧光显微镜注意事项：1、严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；2、检查时间每次以1~2h为宜，最少开机30min才可关机。超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；3、荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。4、灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在30分钟后开启。5、使用完毕后请将干燥剂放回载物台，待整个装置冷却后盖好防尘罩。使用后严格登记制度，对使用时间、使用状态、使用人都要有详细的记录。第49页，共78页，2023年，2月20日，星期三（5）酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)酶联免疫吸附试验

酶与底物反应产生不透明沉积物或有色产物，颜色深浅代表反应的强弱。此颜色深浅可用酶标仪精确地测定出来。第50页，共78页，2023年，2月20日，星期三1、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。第51页，共78页，2023年，2月20日，星期三

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。第52页，共78页，2023年，2月20日，星期三

间接法是检测抗体常用的方法。操作步骤如下：1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗体的量。第53页，共78页，2023年，2月20日，星期三（以间接性ELISA为例）：显色第54页，共78页，2023年，2月20日，星期三2、ELISA试剂的组成完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：

（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；

（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；

（3）酶的底物；

（4）系列参考标准品（定量测定）；

（5）酶标记物及样本的稀释液；

（6）洗涤液；

（7）反应终止液。

第55页，共78页，2023年，2月20日，星期三3、ELISA试剂的作用固相载体：固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。

第56页，共78页，2023年，2月20日，星期三酶标记物：即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。第57页，共78页，2023年，2月20日，星期三

HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。DH2+H2O2

D+2H2O

上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。E第58页，共78页，2023年，2月20日，星期三TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCl或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。第59页，共78页，2023年，2月20日，星期三洗涤液

洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。第60页，共78页，2023年，2月20日，星期三酶反应终止液

常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。参考标准品

定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。第61页，共78页，2023年，2月20日，星期三4、ELISA实验过程加待测样品固相包被加酶标物比色判定结果加终止液加底物温育温育洗涤温育洗涤第62页，共78页，2023年，2月20日，星期三加样

在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加标准品、加样本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加样时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换枪头，以免发

生交叉污染。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。第63页，共78页，2023年，2月20日，星期三封闭

封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。

第64页，共78页，2023年，2月20日，星期三封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的。第65页，共78页，2023年，2月20日，星期三洗涤

ELISA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。第66页，共78页，2023年，2月20日，星期三

洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作主要为浸泡式，过程如下：

a.吸/甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即吸去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸/甩干孔内液体。吸/甩干应彻底，也可吸/甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。第67页，共78页，2023年，2月20日，星期三显色和比色显色

反应的温度和时间是影响显色的因素。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。底物显色一般在室温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，约40分钟将达到显色的顶峰，再延长反应时间，会使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。第68页，共78页，2023年，2月20日，星期三比色

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比

色架中。

比色结果的表达以往通用光密度（oplicaldensity，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下

角，如TMB的吸收波长为450nm，表示方法为"A450nm"或"OD450nm"。第69页，共78页，2023年，2月20日，星期三5、结果判断