医学微生物学试验指导

医学微生物学实验指导沈阳医学院

病原生物学教研室医学微生物学实验指导芳怡方吴凌新兰梅佳芳岚纯JJ芳怡方吴凌新兰梅佳芳岚纯JJ冬：：肖刘刘陈徐方王扁扁扁

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主副参责任编辑校对沈阳医学院病原生物学教研室

（二00六年十二月）刖百为适应医学微生物学的快速发展，培养二十一世纪的实用型人才，提高学生的动手能力，我们在学院有关部门的组织支持下，经过教研室全体教师的共同努力，完成了这本医学微生物学实验指导，希望能借此提高学生的实验课质量，有助于学生对基本理论、基本知识和基本技能的掌握。在选择实验内容和编写体系时，为适应学科的发展，满足教学需要，培养学生理论联系实际，独立思考、独立操作的能力，借鉴其它医学院校相关实验教材的同时，结合我们的实际情况，注意到素质教育和创新性与实践性的培养，为学生知识、能力、素质协调发展创造条件。在编写过程中，尝试为同学编写了病原性球菌感染的鉴定检查设计性实验指导，对每个实验的编写力求实用、简明，条理清晰。本书突出实验原理、实验方法的说明，并提供必要的图表，便于学生对实验原理的理解和方便指导实验操作。面对微生物学层出不穷的新技术，我们以基本实验技术为主，适当编入了细菌分子生物学检查及病毒快速检测等实验项目，实验之后的思考题可便于学生复习、思考、理解和掌握，以期望提高分析问题、解决问题的能力。本实验指导分四部分，第一部分为总论的验证实验，介绍细菌的生物学特征；第二部分为细菌各论，包括以病原性球菌感染为主的设计性实验；第三部分为病毒学实验；第四部分为其它微生物检查（选修）。书后列有相关附录，便于学生查阅。由于编者水平有限，以及编写时间紧迫，书中难免存在缺点和不足，恳请广大师生给予指正，我们将在今后的教学工作中不断加以补充和完善。编者2006年12月实验规则 （1）细菌的形态学实验一显微镜技术及细菌基本形态的观察 徐佳（2）实验二细菌动力的观察 徐佳（4）实验三细菌的特殊结构染色和观察 徐佳（6）实验四革兰染色法 吴怡（8）细菌的生理学实验五细菌培养基的制备 吴怡（11）实验六细菌培养接种技术 吴怡（14）实验七细菌生长曲线的测定实验 吴怡（17）实验八微生物菌种保藏方法 文U新（18）细菌的分布及外界因素对细菌的影响实验九感染监测的微生物学检验和质控 吴怡（20）实验十消毒、灭菌与无菌操作技术 吴怡（21）实验十^一生物安全 吴怡（29）实验十二细菌的代谢产物 陈冬梅（32）实验十三抗生素的抗菌作用（抗生素敏感试验） 刘新（37）实验十四噬菌体对细菌的作用 文U新（38）细菌的致病性实验十五细菌的致病作用 文U新（39）细菌的遗传变异实验十六鼠伤寒沙门菌质粒的提取与鉴定 文U新（41）实验十七L型细菌的检测 方芳（43）细菌学各论实验十八病原性球菌（葡萄球菌）感染检查与鉴定 刘新（44）实验十九抗链球菌溶血素“O”试验 文U新（48）实验二十病原性肠道杆菌的检查 陈冬梅（49）实验二十一肥达反应（血清学实验） 陈冬梅（52）实验二十二白喉杆菌的形态观察 吴怡（54）实验二十三厌氧性细菌 吴怡（55）实验二十四分枝杆菌属的检测 文U兰（56）病毒及其它微生物实验二十五病毒的分离培养 文U新（59）实验二十六病毒血凝及血抑制试验 文U兰（62）实验二十七肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测 文U新（64）实验二十八其它病毒抗原的检测 方芳（64）实验二十九人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体快速检测 刘兰（66）实验三十病毒感染细胞的包涵体检测 文U新（69）实验三十一病毒核酸检测技术 文U新（69）实验三十二螺旋体的检测 方芳（72）实验三十三真菌的检测 方芳（75）附录TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"医学微生物学实验教学大纲 （77）医学微生物学基本词汇英汉对照 （80）医学微生物学实验教学项目表 （87）实验室规则由于医学微生物学实验的对象大都是病原微生物，有传染的危险，为了防止人为感染，必须严格遵守下列规则：一、实验前要做好实验预习，进实验室只带必要的文具、指导，并穿工作服（白大衣）。其它个人物品一律不得带入实验室。二、实验室内应保持清洁、安静，实验时要认真严肃，禁止抽烟、饮食和开玩笑。不得大声喧哗或嬉戏。三、爱护材料，注意节约实验试剂，实验室内任何物品不得带出室外。未经老师允许，不得擅自移动室内实验设施。四、注意安全，若带菌材料污染桌面、地板、书籍和衣物或误吸入口，应立即报告教师进行处理。切勿隐瞒或自作主张不按规定处理。五、按照实验计划进行实验，认真进行实验操作，严格遵守操作规程。爱护实验室内的仪器，使用显微镜及其它贵重仪器时要严格按要求操作，对消耗材料及药品、水电等力求节约。六、实验结束时用过的带菌材料如吸管、玻片等应放在消毒缸、消毒箱等消毒区，污染物放到指定的地方统一处理，不得放在桌上或冲洗于水槽内。应将材料整理好放回原处。清理桌面，洗手后方可离室。值日同学负责湿性打扫实验室，保持室内整齐。并关好水、电、门窗。实验一显微镜技术及细菌基本形态的观察实验类型验证由于细菌体积微小，故在细菌的形态学研究中，经常需要借助显微镜，才能比较清楚地进行观察。因此，同学们必须熟练地掌握油镜的使用及保护方法。一、油镜的使用及保护（一）、油镜头的识别物镜的放大率可由其外形辨认，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数越大；反之，放大倍数越小。油镜头长度大于低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线、白线或蓝线，并刻有100义或oil等字样。（二）、油镜的使用法1、使用显微镜油镜时，必须将显微镜端正直立桌上，不得将镜臂弯曲，以免使载物台倾斜，松柏油流溢，影响观察，污染台面。2、对光：采用天然光为光源时，宜用平面反光镜；若用人工灯光源时，则用凹面镜。首先打开光圈，转动反光镜，使光线集中于集光器。可根据需要，上下移动集光器和缩放光圈，以获得最佳光度。一般用低倍镜或高倍镜观察物象或用油镜检查不染色标本时，需下降集光器并适当地缩小光圈，使光度减弱；若用油镜检查染色标本时，光度宜强。应将显微镜亮度开关调至最亮，光圈完全打开，集光器上升至与载物台相平。图1-1普通光学显微镜3、调焦距:

A、将标本片放置载物台上，用标本推进器固定，将欲检部分移至物镜下。先用低倍镜找出标本的位置，然后提高镜筒，在标本的待检部位滴镜油一滴，再换油镜观察。B、转动粗调节器使载物台徐徐上升（或使镜筒渐渐下降），直至油镜头浸没至油中。此时眼睛应从侧面观察，以免压碎标本片和损坏镜头。C、然后双眼移至目镜，一面从目镜观察，一面反方向缓慢地转动粗调节器（下降载物台，或上升镜筒），当出现模糊物象时，换用细调节器，转动至物象清晰为止。D、观察完毕，应先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。油镜头使用后，应立即用擦镜纸擦净镜头上的油。若镜油粘稠干结于镜头上，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，并随即用干的镜纸擦去残存的二甲苯，以免二甲苯渗入，溶解用以粘固透镜的胶质物，造成镜片移位或脱落。（三）、油镜的使用原理：油镜的透镜很小，光线通过玻片与油镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显现不清。若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率（n=1.52）相近的松柏油（n=1.515）,则使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。1、光线C、D、C,、D’通过载玻片经香柏油折射，使进入物镜中的光线量较多。2、光线A、B、A,、B‘通过载玻片经空气折射，使进入物镜中的光线量减少。图1-2油镜的使用原理（四）、显微镜的维护：1、显微镜是精密仪器，使用时要注意爱护，切勿随意拆卸和碰撞。2、强酸、强碱、氯仿、酒精、乙醚等都能去漆或损坏机件，均需注意不使其接触显微镜。3、细调节器是显微镜最精细、最脆弱的机械部分，每旋转一周使镜筒上升或下降0.1毫米，只能往返回转，即向一个方向转动数周，遇阻力时，应反方向转动。4、不用时将物镜转成“八”字形，载物台降至低点，下降集光器，关上光圈，套上保护罩，双手平托送回。显微镜使用过程中，如发现问题应及时向老师报告并进行登记，以便检修。二、细菌基本形态和特殊结构观察（一）基本形态.球形：葡萄球菌革兰染色标本片G+——菌体正圆形，染成蓝紫色，呈现葡萄串状排列。G+球菌。.杆形：大肠杆菌革兰染色标本片G-——菌体短杆状，染成红色，呈不规则分散排列。G-杆菌。.螺形：霍乱弧菌革兰染色标本片G--菌体弧形，染成红色，呈不规则分散排列。G-弧菌。Rod周围矛头CoccusSpiral5口"GchewcTetrad视野背景为红色，其中可见到染色呈深红色，膜山菌体周围有未染上颜色的空白幽即荚脆Cuboidalpack&ts(S.iFcinae)D^iob^cillus[pair]j二二二SingleStrepiobaciltus s 菌体较粗大杆状，染成蓝灰色，单个或成堆存在,;为细长杆状，顶端有染成蓝色、并StreucomcciJS（二）特殊结构可见到》.荚状菌体，纵向Rod周围矛头CoccusSpiral5口"GchewcTetrad视野背景为红色，其中可见到染色呈深红色，膜山菌体周围有未染上颜色的空白幽即荚脆Cuboidalpack&ts(S.iFcinae)D^iob^cillus[pair]j二二二SingleStrepiobaciltus s 菌体较粗大杆状，染成蓝灰色，单个或成堆存在,;为细长杆状，顶端有染成蓝色、并StreucomcciJS（二）特殊结构可见到》.荚状菌体，纵向.芽胞：体的蓝灰色的鞭毛。于菌梭菌芽胞染色庠—球状物即芽胞苧理“鼓槌状”，其它散乱分布的菌体，为菌体脱落的成熟芽胞。I细菌的荚膜细菌的鞭毛（位置、数量）细菌的芽胞脱落的芽胞实验二细菌动力的观察实验类型验证检查细菌的动力及运动常常通过细菌的不染色标本进行观察。细菌未染色时呈无色半透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同进行观察。有些细菌具有鞭毛，鞭毛是细菌的运动器官，在液体中能从一个部位到另一个部位，称其为具有运动的能力。无鞭毛的细菌不具有真正运动的能力，在液体环境中只是受到液体分子的冲击，发生位置变更不大的颤动（布朗运动）。细菌的动力是有鞭毛细菌的特征，因此观察细菌有无动力（即有无鞭毛）是鉴别细菌的依据之一。（一）悬滴法【原理】细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅需了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细菌鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。【材料】.细菌：变形杆菌、葡萄球菌8-12小时肉汤培养物。.凹玻片，盖玻片，凡士林等。【方法】1.取凹玻片一张，于凹窝周围涂少许凡士林（下图）。.用接种环沾取变形杆菌或葡萄球菌8~12小时培养物，置于盖玻片中央。.反转凹玻片，使凹窝对准盖玻片中央，盖于其上，轻压后，迅速翻转玻片，使盖破片面向上。.标本片置于显微镜载物台上，先用弱光线，低倍镜找物象，再改换高倍镜观察，密切注意，勿压破盖玻片。因凹玻片较厚，油焦距很短，一般不用油镜观察。.镜检观察：先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低集光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动），前者在视野下可见细菌自一处游动至他处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。细菌在镜下为灰色半透明体，并呈现真运动，如在明亮的海洋中，深入浅出游来动去。【结果】有鞭毛的枯草杆菌和假单胞菌可看到活跃的运动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不运动。【注意事项】.检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动。.制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。【思考题】除了悬滴法外，还有什么方法可以鉴别细菌的动力？10实验三细菌的特殊结构染色和观察实验类型验证一、细菌的芽胞染色【目的】掌握细菌的芽胞染色法【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。【材料】.【材料】培养的枯草杆菌（Bacillussubtilis）。.【染色液和试剂】5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液。.【器材】小试管、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。【方法】Schaeffer与Fulton氏染色法（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。（3）染色：①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后用酒精灯火焰加热玻片至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。②水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。③复染：用蕃红液染色5min。（4）水洗、晾干或吸干。（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。【结果】芽胞呈绿色，菌体为红色。二、细菌的鞭毛染色【目的】了解细菌的鞭毛染色法【实验原理】细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。【材料】假单细胞菌（Pseudomonassp.）斜面菌种。Leifson染色液、香柏油、二甲苯。载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、镊子、接种环，显微镜。【方法】（1）清洗玻片选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5—6天，-11-使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。（2）菌液的制备及制片：在染色前将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12—16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有1-2ml无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌，恒温培养12-16h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。（3）Leifson染色法①加染色液使染料覆盖涂片。②水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。③干燥：自然干燥。（4）镜检先低倍观察，再高倍观察，最后用油镜观察，要多找一些视野，不要企图在1-2个视野中就能看到细菌的鞭毛。【结果】菌体和鞭毛均染成红色。【注意事项】.Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经15-20次过滤，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。.染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。.细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。三、细菌的荚膜染色【目的】了解细菌的荚膜染色法【原理】：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。【材料】.肺炎球菌.染色液和试剂：结晶紫、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。.器材：载玻片、玻片搁架，擦镜纸、显微镜等。【方法】.制片：提前数日于小白鼠腹腔注射肺炎链球菌0.2ml,小鼠死亡后解剖，取腹腔液印片。印片自然干燥，无需加热固定。.染色：（1）滴加结晶紫染液，于火焰上加温染色，使冒蒸气，勿水洗。（2）以20%CuSO4溶液冲洗染液，勿水洗，干后镜检。【结果】菌体呈现紫色，荚膜呈淡紫色。-12-实验四革兰染色法实验类型验证由于细菌个体微小，基本上无色透明，故将其用适当染料染色观察，方能显示它的形态、大小、构造及染色特性等，在细菌鉴别上有重要意义。【原理】细菌的等电点较低，约在pH2〜5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或红色。革兰染色是细菌学中使用最广泛的一种染色方法，籍此染色法，可将所有细菌区分为两大类。一、细菌染色标本片的制备（操作）作细菌染色检查，首先要进行细菌标本制备。制备细菌标本一般包括涂片、干燥、固定三步。【材料】.葡萄球菌、大肠杆菌18〜24小时普通琼脂斜面培养物。.革兰染色液。.生理盐水，载物玻片，接种环等。【方法】.涂片：取洁净玻片一张，按以下步骤操作（1）肉汤培养物涂片：①右手拿接种环的黑色胶柄部分，左手托持试管。②接种环以15°角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌，直至金属丝烧红（图1-3）,然后将金属柄部也回旋通过火焰烧灼灭菌。（如图所示）③用右手小指和手掌小鱼肌侧拔下左手所持混合菌液的试管盖，并立即火焰烧灼试管口灭菌。④用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取出菌液（图1-4）。注意勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。⑤再次灭菌试管口，盖好试管，放回原处。⑥将接种环上之菌液涂于载玻片上，制成的菌膜直径约1cm左右。然后将接种环用-13-火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。液体标本（如脓液、痰液等）均可照此法涂片。（2）斜面培养物涂片：用细菌斜面（或平板）培养物涂片，需预先将接种环沾取生理盐水1〜2环置于载玻片中央，然后再按上述无菌操作法从斜面培养物上沾取葡萄球菌或大肠杆菌菌苔少许，混于生理盐水中，轻轻研匀，涂成直径lcm左右的均匀薄膜。2・干燥：涂片最好在室温自然干燥，如需加速干燥，也可将涂面向上，小心地放置离火焰20cm处，远离火焰上方微加温略烘促使干燥（切勿加热过度，以防将标本烧枯）。3•固定：标本干燥后，常用加热固定法。在火焰的最热部分让玻片有菌膜的面向上，通过酒精灯火焰三次（约2〜3秒钟），固定之目的是使细菌蛋白变性，菌体牢固黏附于玻片上，还可杀死细菌，改变菌体对染料的通透性。4.染色。二、革兰染色方法.初染：于涂抹面上滴加结晶紫染液1〜2滴，覆盖涂面，室温染色一分钟。用细流水冲洗剩留染液，甩去片上积水。.媒染：滴加卢戈碘液，室温作用一分钟，细流水冲洗，甩去积水。.脱色：将载玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，边提边看，直至涂面流下的液体无色为止（约30秒钟）。细流水冲洗，甩去积水。.复染：加稀释石炭酸复红染液1〜2滴，染色30秒钟，细流水冲洗，吸水纸吸干玻片水分。.油镜检查【结果】染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫色的为革兰阳性菌，呈红色的为革兰阴性菌。葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以G+表示；大肠杆菌染成红色，为革兰阴性，以G-表示。【注意事项】1、脱色是革兰染色中的关键步骤，脱色过度，可使G+菌被误染为G-菌；脱色不够，则G-菌可被误染为G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，一般以涂片薄而均匀为好。2、G+菌与G-菌的染色反应，还受多种因素如菌龄、染色时间、pH等的影响，只有严格正规操作，才能得到正确结果。【附录】1、与医学有关的常见细菌的革兰染色性：-14-

「葡萄茸菌r瓶球菌、回眼球菌厂球菌।L八庭球窗、肝炎俄球菌势「枯草杆前「需氧多眼杆苗1革兰氏阳性甚芭兰氏阴性菌L炭疽杆菌革兰氏阳性甚芭兰氏阴性菌「理芽胭甚」「破伤风梭菌、J 1厌氮菱胞.极蕾4遂氢藕橙茵J杆菌 L肉毒橙菌、 r白喷杆菌无装腹商《L结核杆菌「胞膜炎球傥广球苗'L海球窗「大腑杆菌、痢疾杆菌、变形秆苗道杆甚J沙门氏菌属：食物中番沙门氏菌、L饰拿耗黄、剂的寒杆菌E肠道杆甚：百日嫁杆菌、鼠疫杆菌一索乱及副霍乱弧菌2、革兰（Gram）染色液的配制（1）结晶紫染液①结晶紫酒精饱和液：取14g结晶紫溶于100ml95%的酒精内。②1%草酸镂水溶液：草酸镂0.8g溶于80ml蒸馏水中。③将已配好之①液20ml和②液80ml混合即成，置瓶中备用。（2）芦戈（Lugol）氏碘液①碘1g;碘化钾2g；蒸馏水300ml②先将碘化钾2g溶于100ml蒸馏水中，再加碘1g,用力摇匀待溶解后加蒸馏水至300ml即成。供革兰染色媒染用。（3）95%酒精（4）石炭酸复红稀释液1份碱性复红饱和液（碱性复红3.2克溶于95%酒精100ml中。即为碱性复红饱和溶液）加9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸复红染液（抗酸染色用），取1份石炭酸复红染液加9份蒸馏水即为稀释复红染液。上述各种染液配成后，均需用滤纸过滤后使用，染液应贮存于棕色瓶内。-15-实验五细菌培养基的制备实验类型验证给细菌提供适宜的条件，细菌即可以生长繁殖，形成具有一定特征的培养物，学习细菌培养技术可以纯化细菌，了解细菌的生长特征，并能进一步检测细菌生化反应、变异性，制备细菌抗原，深入进行分子生物学工作等。了解细菌的培养特征也有助于鉴别细菌。培养基是用人工方法将适合细菌生长繁殖的各种营养物配制而成的营养基质，以供细菌培养使用。一般培养基的主要成分为蛋白质、糖类、盐类、水分等。另外还有一些营养要求较高的细菌，还必须加入血液或血清、鸡蛋、维生素等其它营养物质。有时为了鉴别或抑制某些细菌，则可加入各种专用基质（如某种糖类、氨基酸等），指示剂，染料等。由于对培养基的使用目的不同，故在培养基的选择上有所不同。按其物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。按其成分和用途可分为普通培养基、鉴别培养基、选择培养基和专用培养基等。培养基需加入小试管、中试管、三角瓶、平皿等内使用。培养基的种类很多，但一般制备原则有三条：.足够和适当的营养成分。籍以满足细菌生长繁殖的要求，获得典型细菌培养物，达到研究细菌的形态，生化反应，抗原结构及致病力等方面的目的。.合适的酸碱度。培养基的酸碱度直接影响细菌的生长繁殖。一般细菌最合迹H为7.2〜7.6。测定的方法常用普通比色法或精^H试纸来测定（见附录）。.绝对无菌。培养基务必进行除菌处理，由于培养基所含成分不同，灭菌的方法也不同。如普通培养基常用高压蒸气灭菌法。常用培养基的制备（一）普通肉汤培养基【材料】.新鲜牛肉或牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，蒸馏水。.酚红指示剂，比色架及标准比色管或精^H试纸。.漏斗，量筒，三角烧瓶，试管等。【方法】.称取去脂去腱绞碎的鲜牛肉500克，浸于1000ml蒸馏水中，冰箱过夜，次日煮沸30分钟，纱布过滤，蒸馏水补足其量，（也可用牛肉膏3克加蒸馏水1000ml加热溶化），即为肉浸液。.取肉浸液1000m1，氯化钠5克，蛋白胨10克混合加热溶化。.调整PH为7.6,用滤纸过滤分装于中试管或三角烧瓶内，塞紧棉塞。【用途】供基础培养用，一般营养要求不高的菌均可生长。（二）普通琼脂培养基琼脂是石花菜等海藻类提取的胶体物质，其化学成分主要是多糖。当温度达到98℃以上可溶解于水，45℃以下则凝固。琼脂对细菌一般无营养作用（除自然界中极少数菌可利用琼脂之外），纯属赋形剂。便于人们制做斜面、平板、高层等不同类型的固体培养基。【材料与方法】普通肉汤培养基100m1,加入琼脂2〜3克，加热溶化，用蒸馏水补足失去水分，调整PH为7.6后分装于试管、平皿等器皿中，高压蒸气15磅灭菌20分钟，可制成普通琼脂斜面或普通琼脂平板。【用途】供一般细菌培养用，并可作无糖基培养基。-16-（三）半固体培养基【材料与方法】取普通肉汤培养基100ml,加入琼脂0.5〜0.7克，加热溶化。调^H为7.6,分装于小试管内，每管1〜5ml,高压蒸气灭菌20分钟，待冷后放入4c冰箱备用。【用途】保存一般菌种用，并可观察细菌的动力及生化反应。（四）血液琼脂培养基【材料与方法】将高压灭菌后普通琼脂培养基。冷至45℃〜50℃时以无菌操作加入5%〜10%血液（人或动物脱纤维无菌血液）。可制成血平板和血斜面。【用途】供营养要求较高的细菌分离培养用，亦可观察细菌的溶血特征。（五）伊红美蓝琼脂（EMB琼脂）【材料与方法】蛋白胨10.0g,磷酸氢二钾2.0g,乳糖10.0g,伊红-Y0.4g,美蓝0.065g,琼脂15.0g,蒸馏水1000m1。将以上各成分（伊红和美蓝除外）煮沸溶解于1000m1水中，调pH7.1±0.1。分别加入2%伊红-Y水溶液20ml和0.65%美蓝水溶液10ml,于121℃灭菌15min。【用途】弱选择性平板培养基，主要用于大肠杆菌和产气肠杆菌的分离和鉴别（六）SS琼脂SS琼脂对大肠埃希菌有较强的抑制作用，而对肠道病原菌则无明显抑制作用。因此，可以增加粪便标本的接种量，从而提高病原菌的检出率，故SS琼脂为目前比较满意的肠道杆菌选择性培养基。【材料与方法】际蛋白胨5.0g,牛肉浸膏5.0g,乳糖10.0g,胆盐8.5〜10.0g,柠檬酸三钠8.5g,硫代硫酸钠8.5g,柠檬酸铁1.0g,煌绿0.00033g,中性红0.025g,琼脂13.5g,蒸馏水1000m1。除中性红和煌绿外，其余成分混合于1000m1水中，煮沸溶解。调pH7.0〜7.2。然后加入0.5%中性红水溶液4.5ml及0.1%煌绿水溶液0.33ml,摇匀，煮沸。待冷却至50℃倾入无菌平皿。【原理】SS培养基中除含有基础培养基成分外，以中性红作为指示剂，变色范围pH6.8-8.0,在酸性时呈红色，在碱性时呈淡黄色。凡能分解乳糖的细菌，因为有酸类产生，能使指示剂变红，所以菌落呈现红色；不分解乳糖的细菌，由于它分解蛋白胨产生碱性物质，所以菌落呈淡黄色；能分解蛋白质产生h2s的细菌可与含铁化合物作用而使菌落带有黑色或形成黑心。此外，培养基中含有煌绿，可抑制革兰氏阳性菌生长；胆盐与枸椽酸钠、硫代硫酸钠合用，能加强对大肠杆菌的抑制作用；枸椽酸铁尚能中和煌绿、中性红等染料的毒性作用。【用途】分离沙门菌和志贺菌。大肠埃希菌分解乳糖产酸，通过中性红指示剂呈红色菌落，同时由于与胆盐结合成胆酸发生沉淀，故菌落中心混浊。硫代硫酸钠有缓和胆盐对致病菌的有害作用，并能中和煌绿和中性红染料的毒性。（七）麦康凯琼脂（MAC）【材料与方法】-17-蛋白陈20.0g,氯化钠5.0g,乳糖10.0g,胆盐5.0g,中性红0.3g,结晶紫0.001g,琼脂15.0g,蒸馏水1000m1。将以上各成分（中性红与结晶紫除外）加热溶解于1000m1水中，调pH7.1±0.2。然后加入0.1%结晶紫水溶液1ml和1%中性红水溶液3ml,于121℃灭菌15min【用途】弱选择性平板培养基，主要用于分解乳糖的肠道致病菌。【原理】胆盐能抑制部分革兰阳性菌及部分非病原菌的生长，但能促进某些革兰阴性病原菌生长；因为含有乳糖及中性红指示剂，故分解乳糖的细菌，菌落呈红色（如大肠杆菌），不分解乳糖的细菌，菌落不呈红色。（八）双糖铁培养基（用成品制备）【成分】上层：蛋白豚1g下层：蛋白豚1g乳糖1g葡萄糖0.2g硫酸亚铁镂0.02g氯化钠0.5g氯化钠0.5g酚红2mg酚红2mg琼脂0.3g琼脂1.1g【制法】（1）先称取下层粉末2克加入100ml蒸馏水，放置数分钟后加热溶解，分装于试管中，于8磅15分钟灭菌，取出后垂直凝固，待此下层培养基凝固后，再以无菌操作方法加入上层培养基。（2）称取上层粉末3.65克加入100ml蒸馏水，放置数分钟后加热溶解装瓶，于8磅15分钟灭菌后冷却至70℃左右，再以无菌操作加到凝固的下层培养基上面，立即制成斜面备用。"I：【原理】培养基中除含有基础营养成分外，以酚红作指示剂（碱性时为红色，酸性时为黄色），可鉴别细菌分解其中糖类及氨基酸的能力，凡能分解葡萄糖的，则使培养基底层变黄，凡能分解乳糖的，则使斜面变黄；能分解糖类产生气体的，可使培养基断裂后出现气泡；能分解含硫氨基酸的，可产生Hf与硫酸亚铁生成黑色化合物，使培养基显示黑色。双糖管培养基示意图（九）疱肉培养基【材料与方法】牛肉浸液1000m1,蛋白陈30.0g,酵母膏5.0g,磷酸二氢钠5.0g,葡萄糖3.0g,可溶性淀粉2.0g,碎肉渣适量，pH7.8。称取新鲜除脂肪和筋膜的碎牛肉500g,加蒸馏水1000m1和1mol/L氢氧化钠溶液25ml,搅拌煮沸15min,充分冷却，除去表层脂肪，澄清，过滤加水补足至1000m1。加入除碎肉渣外各种成分，校正pH。碎肉渣经水洗后凉至半干，分装15mmx150mm试管2〜3cm高，每管加还原铁粉0.1〜0.2g或铁屑少许。将上述液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约1cm。上面覆盖溶化的凡土林或液体石蜡0.3〜0.4cm。121℃灭菌15min。【用途】用于肉毒梭菌的增菌培养。-18-（十）“Lowenstein-Jensen”培养基（罗氏培养基）【材料与方法】磷酸二氢钾0.96g,硫酸镁®gSQ-7H0°.°48g,天门冬酰胺0.72g,甘油（中性）2.4ml,枸椽酸镁0.12g，蒸馏水120ml，马铃薯粉6.0g，新鲜鸡蛋6〜8只，1%孔雀绿溶液8ml1、将天门冬酰胺，磷酸二氢钾，枸椽酸镁及甘油加水后，置沸水浴中加热溶解。2、加入马铃薯粉，继续在沸水浴中加热30分钟，时加搅拌，使成均匀糊状。3、待冷至60℃，加入新鲜全蛋液200ml及1%孔雀绿8ml，充分搅匀后，用双层纱布过滤。4、分装于20X150mm试管中，每管约8ml，塞紧，置成长斜面。5、用85℃50分钟流通蒸气灭菌后，经37℃孵育48小时，证明无菌生长；冷置备用。6、管内如无凝结水，可加无菌生理盐水0.5ml以防在贮存期中培养基干燥。7、以无菌操作换上软木塞，置37℃培养48小时，无菌生长即可应用。【用途】主要用于分枝杆菌的分离培养。（十一）巧克力色琼脂平板的制备【材料】肉汤琼脂100ml无菌脱纤维羊或兔血10ml。【方法】（1）将肉汤琼脂加热溶化，趁热加入脱纤维血，摇匀。（2）倾注平板，待冷却成巧克力色，备用。【用途】用于培养脑膜炎双球菌或淋球菌。【说明】加血一定要趁热加。实验六细菌培养接种技术实验类型验证由于细菌感染而致病的各种标本及带菌者所需检查的各种标本，往往并非单一的细菌，而且混有其它非致病菌（人体正常菌群）。因此当对此标本需作出细菌鉴定时，就必须从标本中分离出致病菌，称为细菌分离培养技术。另外，对已得到可疑病菌进行细菌鉴定及菌种保存等培养，称为纯培养接种技术。无菌操作技术：为了在研究某种微生物的过程中减少其它微生物的干扰和影响，必须为所研究的微生物提供一个无其它杂菌的环境，创建这一环境的技术即为无菌技术。在实施无菌技术中，须牢记自然环境中微生物是无处不在的，从而在无菌操作中形成必要的“无菌概念”。所有无菌实验操作都是建立在此观念上。在微生物学实验中，无菌操作主要包括斜面接种、液体接种、平板接种、倒制平板和稀释分离等。（一）平板划线接种法（又称分离培养法）平板分离划线的方法较多，其中以分区划线法与曲线划线法较为常用。其目的都要使细菌呈现单个菌落生长，便于同杂菌菌落鉴别。现只介绍分区划线法。【材料】.细菌：大肠杆菌、葡萄球菌18〜24小时普通琼脂斜面培养物。.培养基：普通琼脂平板。-19-

.酒精灯，接种环等。【方法】用接种环挑取菌种后在平板上经分段划线分离，可得到纯种细菌。A、B、C分别为1、2、3次画线图3图3平板划线法图4姆育后菌落的散布情况①在酒精灯火焰上灼烧接种环，待冷却，取一接种环金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的混合菌液。②左手握住琼脂平板，用大拇指和食指稍抬起皿盖，同时靠近火焰周围，右手持接种环伸入皿内，在平板上一个区域作“之”形来回划线。划线时使接种环与平板表面成30。〜40°角轻轻接触，以腕力在表面作较快的滑动，勿使平板表面划破或嵌进培养基内。③灼烧接种环，以杀灭接种环上剩余的菌液。待冷却后，再将平皿转动一定的角度，接种环通过划过线的区域，在第二区域继续划线。④划毕后再灼烧接种环，冷却后用同样的方法在其它区划线。全部划线完毕后，在平皿底注明菌种、组别、姓名和日期等。将培养皿倒置放入恒温箱培养。适当温度培养一段时间后，取出观察。（二）纯培养细菌接种法-20-1.斜面培养基接种法：用于培养，保存菌种及其它实验用。【材料】（1）大肠杆菌，葡萄球菌18〜24小时琼脂斜面培养物。（2）普通琼脂斜面培养基。（3）接种环，接种针，酒精灯等。【方法】图3-1斜面接种时的无菌操作（1）接种环灭菌（2）开启棉塞（3）管口灭菌（4）挑起菌苔（5）接种（6）管口灭菌，盖好试管塞①操作前，先用75%乙醇擦手，待乙醇挥发后才能点燃酒精灯。②将斜面菌种管和欲接种的斜面试管同时拿在左手的大拇指和其它四指之间，长有菌苔的一面向上，并处于水平位置。③先将菌种管和试管的棉塞旋松，便于接种时取出。④右手拿接种环，与通常拿笔一样。将要伸入管内部分的金属柄和金属丝在酒精灯焰上灼烧灭菌。⑤用右手小指、无名指及手掌将菌种管和试管的棉塞同时拔出，并把棉塞握住，不要随意放在桌上或与其它物品相接触，再以火焰烧管口。将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内，接取菌种前先在管内壁上或未长苔的培养基面上接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种。用接种环轻轻刮取少许苔后，自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿再通过火焰。迅速将沾有菌种的接环伸入待接种的斜面培养基试管内，由里到外划折线，使菌体粘附于培养基上。划线时，勿用力划破培养基。若以保存菌为目的时可自管底上划一粗直线即可。接种完毕后将接种环抽出，灼烧管口，塞上棉塞。加棉塞时，不要用试管口去迎塞，以免试管在移动时污染杂菌。接种环在放回原位前，要经火焰灼烧灭菌。接种菌应作好标记，标明菌种名称，日期等，置37℃温箱中培养，次日观察结果。.液体培养基接种法：用于增菌及鉴定细菌生长特点，如表面生长，沉淀生长，均匀混浊生长等。【材料与方法】①由斜面菌种接入液体试管培养基：操作方法与前面的斜面接种相同，但应使液体管口向上倾斜，以免培养液流出。接入菌体后，让接种环与管内壁轻轻研磨，使菌体从接种环上脱落到溶液中。接种后塞好棉塞，将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。②由液体培养基接种液体试管培养基：菌种如为液体时，接种除用接种环外，也可无菌吸管或滴管。只需在火焰旁拔去棉塞，用无菌吸管吸取菌液后注入培养液内，摇匀即可。置37℃温箱中培养，次日观察结果。-21-

.半固体培养基穿刺培养法用于保存菌种及间接观察细菌之动力（无动力之细菌仅沿穿刺线生长，清晰可见；有动力的细菌使培养基呈现混浊样，穿刺线甚至难以看出）。用无菌操作技术，灭菌穿刺针沾取细菌后，垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处，再沿原穿刺线抽出即可，置37℃温箱培养，次日观察结果。实验七细菌生长曲线的测定实验实验七细菌生长曲线的测定实验实验类型验证【目的】了解细菌生长曲线特点及测定原理学习用比浊法测定细菌的生长曲线【原理】将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。【材料】菌种：大肠杆菌培养基： 肉膏蛋白胨培养基仪器和器具：721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。【方法】流程： 菌液一标记一接种一培养一测定1、制备菌液： 取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静置培养18h。2、标记编号：取盛有50ml无菌肉膏蛋白胨培养液的250ml三角瓶11个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。3、接种培养：用2ml无菌吸管分别准确吸取2ml菌液加入已编号的11个三角瓶中，于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将三角瓶取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。4、生长量测定：将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10〜0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。【结果】将测定的OD值填入下表：-22-时间（h） 0 1.53 4 6 8 10 12 14 16 20光密度值（OD600 以上述表格中的时间为横坐标，OD60G值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。实验八微生物菌种保藏方法实验类型验证菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。一、常规保藏方法【目的】.了解菌种保藏的基本原理.掌握几种常用的菌种保藏方法。【原理】微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境，即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法。【材料】.菌株：待保藏的适龄菌株斜面.培养基：肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。.试剂：10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。.器材：用于菌种保藏的小试管（10X100毫米）数支、5ml无菌吸管、lml无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子（40目、120目）、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。【方法】斜面保藏一半固体穿刺保藏一石蜡油封存一砂土管保藏【步骤】.斜面保藏：标记试管一接种一培养一保藏取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。.斜面接种：将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。置37恒温箱中培养48小时。保藏：斜面长好后，直接放入4c的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏三个月至半年。.半固体穿刺保藏：标记试管一穿刺接种-培养—保藏取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。.穿刺接种：用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直-23-刺至试管底部，然后又沿原线拉出。置37℃恒温箱中培养48小时。保藏：半固体直立柱长好以后，放入4c的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。.石蜡油封存：标记试管一接种-培养-加石蜡油―保藏无菌操作下将5ml石蜡油倒至培养好的菌种上面，加入的量以超过斜面或直立柱1厘米高为宜。石蜡油封存以后，同样放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低温干燥处保藏。这种方法保藏期一般为一至二年。二、冷冻干燥保藏法【目的】理解冷冻干燥保藏菌种的原理掌握冷冻干燥保藏菌种的方法。【原理】冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。利用有利于菌种保藏的一切因素，使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一'。【材料】.待保藏的各种菌种。.试剂：液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95%乙醇、10%盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰牛奶。3.器材无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安甑管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条（0.5义1.2cm）、干燥器、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱（一30℃）、超低温冰箱和液氮罐等。标签、脱脂棉、离心机、冷冻真空装置、高频电火花器。【方法】备安甑管一备脱脂乳-制菌悬液一分装一预冻一真空干燥一保藏一活化1、安甑管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。将标签放入安甑管内，管口塞上棉花，灭菌备用。2、制备脱脂乳：用鲜奶经处理或使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，灭菌，并做无菌试验后备用。3、制菌悬液：将无菌牛奶直接加到待保藏的菌种斜面内，用接种环将菌种刮下，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。4、分装：用无菌长滴管将悬浮液分装入安甑管底部，每支安甑管的装量约为0.9ml。（一般装入量为安甑管球部体积的1/3）5、预冻：将分装好的安甑管在-25℃至-40℃之间的干冰酒精中进行预冻1小时；或在冰箱冷冻室进行预冻。6、真空干燥：预冻以后，将安甑管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。7、封管：封管前将安甑管装入歧管；真空度抽至0.01毫米汞柱后，再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安甑管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。检查时高频电火花器应射向安甑管的上半部。8、保藏：做好的安甑管应放置在低温避光处保藏。9、活化：如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，然后将安甑管上部在火焰上烧热，再滴几滴无菌水，使管子破裂。再用接种针直接挑取松散的干燥样品，在斜面接种。【思考题】.菌种保藏中，石蜡油的作用是什么？-24-.经常使用的细菌菌株，使用哪种保藏方法比较好？【注意事项】.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。.熔封安甑瓶时防止封闭不严。.液氮冻存操作应防止冻伤。实验九感染监测的微生物学检验和质控实验类型验证一、人体体表及各种物品表面的细菌检查一拭子法和涂抹法【材料】普通琼脂平板。【方法】取普通琼脂平板一个，在平板底面用记号笔或蜡笔将平板分成若干等份，于每份培养基表面分别用手指、衣物、书本、笔等轻轻涂抹（不要擦破培养基）。也可用无菌生理盐水擦洗衣物等，用无菌棉拭子涂于培养基表面，盖上皿盖，分别标记清楚。置37℃温箱培养18〜24小时观察结果。观察各种物品中细菌的数量及类别，并分析其意义。【注意事项】本实验检出的除细菌外，尚可能有真菌、放线菌等，请注意加以区别。二、人咽喉部位的细菌检查【材料】血液琼脂平板。【方法】咳碟法取血液琼脂平板一个，打开皿盖，将培养基面置于口腔前约10厘米处，用力咳嗽数次（让飞沫落在培养基表面），然后盖上皿盖，注明被检查者姓名、实验日期等。量7c培养18〜24小时观察结果。观察细菌的数量、种类等，注意是否有溶血环，并分析其意义。三、紫外线的杀菌试验【原理】波长240nm〜280nm的紫外线，因与DNA吸收光谱一致，而具有明显的杀菌作用。其机制是使细菌DNA链中两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而破坏DNA构型，干扰其正常复制，导致细菌死亡。【材料】.菌种：大肠杆菌18〜24小时琼脂斜面培养物。.培养基：普通琼脂平板。.无菌黑色图案纸片，紫外线灯，消毒液。【方法】.用接种环取大肠杆菌琼脂斜面培养物，密涂于普通琼脂平板培养基表面。.火焰灭菌小镊子、待稍凉后，打开平皿盖，取无菌黑纸片一片平贴于涂有细菌的平板培养基表面中间。.将平板暴露于距紫外灯管20〜30cm处，打开紫外线灯照射30分钟。.照射完毕，无菌操作取出黑纸片，投入消毒液中，盖上皿盖，做标记，注明日期，试验者等。.置37℃培养18〜24小时，观察培养基表面细菌生长情况、并分析其结果。【结果】-25-黑纸片遮盖处细菌生长形成灰白色菌苔，形状同黑纸片形状。直接暴露在紫外线灯下的培养基表面无生长或仅有少量的细菌生长，形成菌落。【应用】紫外线的杀菌力虽强，但穿透力弱，故仅用于实验室、手术室空气及物体表面的消毒灭菌。【注意事项】杀菌波长的紫外线对人体皮肤，眼睛有损伤作用，使用时应注意防护。实验十消毒、灭菌与无菌操作技术实验类型验证【原理】采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌（sterilization）。消毒（disinfection）则是用较温和的物理或化学法杀死物体上绝大多数微生物（主要是病原微生物和有害微生物的营养细胞），实际上是部分灭菌。在微生物、动植物细胞、分子生物学实验、生产和科学研究工作中，需要进行细胞、微生物纯培养，不能有任何外来杂菌。因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温的致死作用，主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比干热灭菌好。这是因为湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。【常用灭菌技术和分类】.干热灭菌干热灭菌包括火焰灭菌和干燥热空气灭菌。微生物接种工具如接种环、接种针或其它金属用具等，可直接在酒精灯火焰上灼烧进行灭菌。这种方法灭菌迅速彻底。此外，接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。用干燥热空气杀死微生物的方法称为干热灭菌。通常将灭菌物品用锡箔纸包裹好或放入灭菌专用的铁盒（或铝盒）内，置于鼓风干燥箱内，在160c〜170c加热1〜2h。灭菌时间可根据灭菌物品性质与体积作适当调整，以达到灭菌目的。玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适于用其它方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。.湿热灭菌湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌，在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：①热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其它相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；②热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；③蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理15min后即可杀死，真菌的孢子要耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死，而细菌的芽胞更耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。根据灭菌时压力大小可以分为常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。常压蒸汽灭菌在不能密-26-

蒸汽压力(表压)蒸汽温度 菌，方法是Kg/cm2MPa℃下将待灭菌的0.000.00100212培养基在100℃下蒸0.25O.025107.0224煮30〜0.50O.050112.023460min,以杀0.750.075115.5240死其中所有1.000.100121.0250微生物的营1.50O.150128.0262养细胞，然2.000.200134.5274后置室温或20〜30℃下闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。所用的灭菌器有阿诺氏(Aruokd)灭菌器或特制的蒸锅，也可用普通的蒸笼。常压蒸汽灭菌比较有代表性的是巴氏消毒法和间歇灭菌法。巴氏消毒法是用于牛奶等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中的无芽胞病原菌，而又不影响其特有风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在85℃下保持5min即可。间歇灭菌法又称分段灭菌法，适用于不耐热培 养基的灭20〜30℃下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。高压蒸汽灭菌将水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100c以上。为达到灭菌效果，一般要求温度达到121c(压力为0.1MPa),维持15〜30min。也可采用在较低的温度(115℃,即0.075MPa)下维持35min的方法。蒸汽压力与温度的关系表中所示。在使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时，蒸汽灭菌器内冷空气的排除是否完全极重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压。所以当水蒸汽中含有空气时，压力表所表示的压力是水蒸气压力和部分空气压力的总和，不是水蒸气的实际压力.它所相当的温度与高压灭菌锅内的温度是不一致的。这是因为在同一压力下的实际温度，含空气的蒸汽低于饱和蒸汽。见下表所示。表空气排除程度与温度的关系压力表读数灭菌器内温度/℃/Pa未排除空气排除1/3空气排除1/2空气排除2/3空气完全排除气357290109941007090100115105109105100109121112115140109115126118121175115121130124126210121126128130135由上表看出：灭菌锅中的空气排除不干净，达不到灭菌所需的实际温度。因此，必须将灭菌器内的冷空气完全排除，才能达到完全灭菌的目的。在空气完全排除的情况下，一般培养基只需在O.1MPa下灭菌30min即可。但对某些物体较大或蒸汽不易穿透的灭菌物品，如固体曲料、土壤和草炭等，则应适当延长灭菌时间，或将蒸汽压力升到0.15MPa保持1〜2h。SYQ、STY-280型手提式压力蒸汽灭菌消毒器使用方法-27-

⑴堆放消毒的物品应予以妥善包扎，各包之间留有间隙堆放在隹桶的筛板上。这样可有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果。2）在主体内加入清水至4升，使水位一定要超过电热管，连续使用时，必须在每次消毒前补足上述水量，以免因缺水而不能正常工作。⑶将堆好物品的消毒桶放在主体内。然后把盖上的放气软管插入消毒桶内侧的圆槽内。对正盖与主体的螺栓槽，顺序地将相对开立的翼形螺母予以均匀旋紧，使盖与主体密合。）将消毒器接上与铭牌标志电压一致的电源，插上电源插座电热；通电开始工作。在加热开始时，应将放阀的摘子堆至垂直放气方，使冷空气随着加热由桶内逸去。等有较急的蒸汽喷出时，即将摘子板回水平“关闭”方位。此时压力表指针应加热而随着逐渐升，指示出消毒器的压力和温度。当压力到达所需的范围时，开始计算消毒所需时间，并使之维持恒压当达到0.14兆帕124-126摄氏度消毒时，则安全阀能使之维持恒压。⑹对物品在消毒后要迅速干燥，可在消毒终了时将消毒器内的蒸汽通过放气阀予以迅速排出，待压力表指针回复至零位，使物品上残留水蒸汽得到蒸发，随着将电源切断停止加热，（消毒液体时严禁使用干燥方法。）⑺消毒结束时，必须先将电源切断，停止加热待其冷却，直至压力表指针回复位至零位，再待数分钟后排去余气后，才能将盖开启。Selecta全自动高压蒸汽灭菌锅⑴Selecta全自动高压蒸汽灭菌锅仪器面控制板.有指示灯的电源开关.门状态指示.缺水指示.循环结束指示.液态物质灭菌选择键.固体物质灭菌选择键.固体+液体物质灭菌选择键.温度显示.温度设定选择键.参数增加键.参数减少键.干燥时间显示.时间指示.时间设定键.开始键.程序序号指示.程序选择.停止键.报警指示灯.注水阀-28-

自动高压蒸汽灭菌锅仪器面控制板MLS-3750高压自动灭菌锅⑵$616"2全自动高压蒸汽灭法①打开电源开关1图MLS-3750自动高压蒸汽灭菌锅仪器面控制板MLS-3750高压自动灭菌锅⑵$616"2全自动高压蒸汽灭法①打开电源开关1图MLS-3750高压自动灭菌锅-29-.内部水箱注水口.空气过滤器.安全阀.干燥控制温度调节器.安全温度调节器.废水排放阀.蒸汽排放阀.入水口.冷凝水出口.水箱排放阀②确认蒸汽排放阀处于关闭状态③放入待灭菌物品④关上灭菌锅盖，将固定螺杆旋紧，门开关指示灯灭。⑤选择灭菌程序，Selecta全自动高压蒸汽灭菌锅灭菌程序有两种方式：分别为手动灭菌程序、自动灭菌程序。PRESSURE，出*"AW%Sbam压力表II灭苗过程指示窗u一火菌温度指小窗“一调我键灭菌时间指示窗选捽键时间选择键(1)接通电源。检查排气阀是否关闭，应处于关闭状态。(2)检查冷凝桶内水位。(3)将待灭菌材料放入后关上盖，LEVELLOCK灯应处于熄灭状态。(4)选择所需的灭菌温度和灭菌时间，选定后即可开始。(5)待灭菌完毕后，等温度降至60℃以下，压力表示为零后方可打开锅盖，取出灭菌材料。图3.徇程序选择键-30-图3-8VS-1300-U型洁净工作台(1)使用前应提前开机，打开紫外灯和风机开关15〜20分钟。(2)新安装的或长期未使用的净化工作台，使用前必须对净化工作台和周围环境用超净真空吸尘器或不产生纤维的工具认真进行清洁工作。(3)工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。(4)禁止在工作台面上记录，工作时应尽量避免作明显扰乱气流的动作。(5)定期(一般每二月一次)，用热球式电风速计测量工作区风速，如发现不符合技术参数的要求，则可调大风机供电电压。(6)经常注意工作台上压差表的指针，当指针从绿色区进入红色区时，说明此高效空气过滤器的容尘量已饱和，应调大风机电压，须再用风速计测量工作区风速，当平均风速<0.3m/s时，应予以更换。【注意事项】干热灭菌时：(1)灭菌的玻璃器皿切不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌中容易炸裂。(2)灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。(3)灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包装纸或棉花被烤焦。(4)灭菌温度恒定在160〜170℃为宜。温度超过180℃,棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。(5)降温时，需待温度自然降至60℃以下才能打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。(6)培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。湿热灭菌时：(1)不要将灭菌锅安装在有易燃气体或液体的地方，确认仪器所注电压与当地电压相同，蓝线为零线，棕线为火线，黄/绿线为地线，务必要将仪器接地良好。(2)每次使用前，应检查灭菌锅内有足够水量，使水位过电热管。(3)摆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的出气孔，必须留出空位保证其畅通放汽，否-31-则安全阀因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。(4)每次开门前，一定要检查确认锅内无压力！压力指示表必须指示为01(5)如果使用仪器的过程中发现有超温及超压等异常现象，请断开电源，开关处于OFF位置，并将插头从电源处拔下，待机器压力降下来为零时，再打开锅盖进行检查。(6)灭菌液体时，应将液体灌装在硬质的耐热玻璃瓶中，以不超过3/4体积为好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞。(7)对不同类型，不同消毒物要求的物品，如敷料和液体等，切勿放在一起消毒，以免顾此失彼，造成损失。(8)平时应将设备保持清洁和干燥，方可延长使用年限，橡胶密封垫使用日久会老化，应定期更换。(9)安全阀应定期检查其可靠性，工作压力超过0.165兆帕时需要更换合格的安全阀。使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100c后，开始计算灭菌时间。使用洁净工作台时：(1)根据环境洁净程度，定期将预过滤器中的滤料拆下清洗，间隔时间一般为3-6个月。(2)当风机组电压调到最大时，工作区风速仍达不到0.3m/s,则必须更换高效空气过滤器,本设备高效过滤器外形尺寸为820X600X69mm,二只。(3)更换高效过滤器时，可打开机箱后盖，更换时应注意过滤器上的箭头标志，箭头指向即为单向流气流流向。(4)更换高效空气过滤器后，应用测尘仪检查四周边密封是否良好。调节电机组电压，使工作区平均风速保持在0.4±20%m/s范围内,用测尘仪检查净化等级。(5)配电板装在工作台右下方电器箱内，电器故障可参照电器原理图。.过滤除菌过滤除菌即将液体通过某种微孔的材料，使微生物与液体分离。早年曾采用硅藻土等材料装人玻璃柱中，当液体流过柱子时菌体因其所带的静电而被吸附在多孔的材料上，但现今已基本为膜滤器所替代。膜滤器采用微孔滤膜作材料，它通常由硝酸纤维素制成，可根据需要使之具有从0.025Mm〜25|Jm不同范围大小的特定孔径。当含有微生物的液体通过孔径为0.2pm的微孔滤膜时，大于滤膜孔径的细菌等微生物不能穿过滤膜而被阻拦在膜上，与通过的滤液分离开来。微孔滤膜具有孔径小、价格低、可高压灭菌、滤速快及可处理大容量的液体等优点。过滤除菌可用于对热敏感液体的除菌，如含有酶或维生素的溶液、血清等。有些物质即使加热温度很低也会失活，也有些物质辐射处理也会造成损伤，此时过滤除菌就成了惟-32-一的可供选择的灭菌方法。过滤除菌还可用于啤酒生产中代替巴斯德消毒。有些微生物学研究工作需要收集或浓缩细菌细胞时，可在隔板中带有0.22pm孔径的微孔滤膜的注射装置。在菌液注射过程中，细菌细胞由于不能通过滤膜而被收集在膜表面。使用O.22rm孔径滤膜虽然可以滤除溶液中存在的细菌，但病毒或支原体等仍可通过。必要时需使用小于0.22pm孔径的滤膜，但滤孔容易阻塞。.紫外线杀菌紫外光杀菌作用是因为它可以被蛋白质（波长为280nm）和核酸（波长为260nm）吸收，造成这些分子的变性失活。例如，核酸中的胸腺嘧啶吸收紫外光后，可以形成二聚体，导致DNA合成和转录过程中遗传密码阅读错误，引起致死突变。波长在260nm左右的紫外线杀菌作用最强。紫外灯是人工制造的低压水银灯，能辐射出波长主要为253.7nm的紫外线，杀菌能力强而且较稳定。紫外光穿透能力很差，不能穿过玻璃、衣物、纸张或大多数其它物体，但能够穿透空气，因而可以用作物体表面或室内空气的杀菌处理，在微生物学研究及生产实践中应用较广。紫外灯的功率越大效能越高。紫外线的灭菌作用随其剂量的增加而加强，剂量是照射强度与照射时间的乘积。如果紫外灯的功率和照射距离不变，可以用照射的时间表示相对剂量。紫外线对不同的微生物有不同的致死剂量。根据照射定律，照度与光源光强成正比而与距离的平方成反比。在固定光源情况下，被照物体越远，效果越差，因此，应根据被照面积、距离等因素安装紫外线灯。由于紫外线穿透力弱，一薄层普通玻璃或水，均能滤除大量的紫外线。因此，紫外线只适用于表面灭菌和空气灭菌。在一般实验室、接种室、接种箱、手术室和药厂包装室等，均可利用紫外灯杀菌照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒剂，可加强灭菌效果。紫外线对眼黏膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以应避免在紫外灯下工作，必要时需穿防护工作衣帽，并戴有色眼镜进行工作。.化学药剂消毒与杀菌某些化学药剂可以抑制或杀死微生物，因而被用于微生物生长的控制。依作用性质可将化学药剂分杀菌剂和抑菌剂。杀菌剂是能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂，如重金属离子和某些强氧化剂等。抑菌剂并不破坏细菌的原生质，而只是阻抑新细胞物质的合成，使细菌不能增殖，如磺胺类及某些抗生素等。化学杀菌剂主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和周围环境中的微生物。抑菌剂常用于机体表面，如皮肤、黏膜、伤口等处防止感染，也有的用于食品、饮料、药品的防腐作用。杀菌剂和抑菌剂之间的界线有时并不很严格，如高浓度的石碳酸（3%—5%）用于器皿表面消毒杀菌，而低浓度的石碳酸（0.5%）则用于生物制品的防腐抑菌。理想的化学杀菌剂和抑菌剂应当是作用快、效力高但对组织损伤小，穿透性强但腐蚀小，配制方便且稳定，价格低廉易生产，并且无异味。。此外，微生物种类、化学药剂处理微生物的时间长短、温度高低以及微生物所处环境等，都影响着化学药剂杀菌或抑菌的能力和效果。微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、乙醇、碘酒、龙胆紫、石炭酸、煤粉皂溶液、漂白粉、氧化乙烯、丙酸内酯、过氧乙酸、新洁尔灭等。常用化学杀菌剂的使用浓度和应用范围如下表所示。常用化学杀菌剂类别实例常用浓度应用范围醇类乙醇70%〜75%皮肤及器械消毒酸类乳酸0.33〜1mol/L空气消毒（喷雾或熏烝）食醋3〜5ml/m3熏蒸空气消毒，可预防流感碱类石灰水1%〜3%地面消毒、粪便消毒等-33-酚类石炭酸5%空气消毒、地面或器皿消毒来苏儿2%〜5%空气消毒、皮肤消毒醛类甲醛（福尔马林）40%溶液2〜6ml/m3接种室、接种箱或器皿消毒升汞0.1%植物组织（如根瘤）表面消毒重金属离子硝酸银O.1%〜1%皮肤消毒硫柳汞0.01%生物制品防腐高锰酸钾0.1%〜3%皮肤、水果、蔬菜、器皿消毒过氧化氢3%清洗伤口、口腔黏膜消毒氧化剂氯气0.2〜lppm饮用水消毒等漂白粉1%〜5%培养基容器、饮水和厕所消毒过氧乙酸0.2%〜0.5%塑料、玻璃、皮肤消毒等染料结晶紫2%〜4%外用紫药水、浅疮口消毒表面活性剂新洁尔灭1:20水溶液皮肤及不能遇热器皿的消毒季胺盐类杜火芬（消毒宁）O.05%〜0.1%皮肤疮伤冲洗、棉织品、塑料、橡胶物品消毒烷基化合物环氧乙烷50mg/100ml手术器械、敷料、糖瓷类灭菌金属螯合剂8—羟喹啉硫酸盐0.1%〜0.2%外用清洗消毒【思考题】.为什么灭菌器内需要灭菌的物品不能摆的太密？.干燥箱灭菌的温度是多少？灭菌结束后要注意什么？.比较干燥箱灭菌和高压灭菌器灭菌的优缺点，并说出原因。.进行无菌操作时，应注意那些方面的问题。.使用洁净工作台进行无菌操作时，操作者的动作应该注意那些问题。实验十一生物安全实验类型验证为了加强病原微生物实验室生物安全管理，对我国境内的实验室及其从事实验活动的人员实行生物安全管理，国家发布国务院令（第424号）《病原微生物实验室生物安全管理条例》于2004年11月起施行。病原微生物，是指能够使人或者动物致病的微生物。实验活动，是指实验室从事与病原微生物菌（毒）种、样本有关的研究、教学、检测、诊断等活动。【生物安全水平分级】根据所操作的生物因子的危害程度和采取的防护措施，将生物安全防护水平（biosafetylevel，BSL）分为4级，I级防护水平最低，IV级防护水平最高。以BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示实验室的相应生物安全防护水平。【实验室设施和设备要求】BSL-1实验室：1）无需特殊选址，普通建筑物即可，但应有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计。2）每个实验室应设洗手池，宜设置在靠近出口处。3）在实验室门口处应设挂衣装置，个人便装与实验室工作服分开放置。4）实验室的墙壁、天花板和地面应平整、易清洁、不渗水、耐化学品和消毒剂的腐蚀。地面应防滑，不得铺设地毯。5）实-34-

验台面应防水，耐腐蚀、耐热。6）实验室中的橱柜和实验台应牢固。橱柜、实验台彼此之间应保持一定距离，以便于清洁。7）实验室如有可开启的窗户，应设置纱窗。实验室内应保证工作照明，避免不必要的反光和强光。应有适当的消毒设备。BSL-2实验室：1）实验室门带锁并可自动关闭。实验室的门有可视窗。2）有足够的存储空间摆放物品以方便使用。在实验室工作区域外还应