植物原生质体培养

植物原生质体培养第一页，共二十九页，2022年，8月28日一、两个概念再生植株工程植株第二页，共二十九页，2022年，8月28日第三页，共二十九页，2022年，8月28日二、原生质体分离

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材料来源植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。

植株的年龄和生长条件是十分重要的。第四页，共二十九页，2022年，8月28日来源：

①无菌苗

②温室培养的苗培养条件：低光照强度（1000lx）短日照温度为20～25℃相对湿度为60%～80%以及充足的氮肥供应。

第五页，共二十九页，2022年，8月28日

2前处理

要保证酶解能充分的进行，必须促使酶溶液渗入到叶片细胞间隙中。为此，要做到：撕去叶片的下表皮，以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶液中。或把叶片切成小块，结合真空处理效果更好。或用金刚砂摩擦叶的下表皮。

第六页，共二十九页，2022年，8月28日3提取方法①机械分离法（Machanicalisolation）②酶法分离（Enzymaticisolation）第七页，共二十九页，2022年，8月28日早在1892年，克莱若克（Klercker）就已采用机械法分离原生质体。

方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织，在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。

缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能用此法。①机械法第八页，共二十九页，2022年，8月28日第九页，共二十九页，2022年，8月28日②酶解法

1960年Norkinghan大学的植物生理学家Cooking用酶法降解细胞壁，获番茄根尖原生质体，开创了大量获得原生质体的的方法。

20世纪九十年代以来，国内外原生质体培养取得了突飞猛进的发展。1971年，Takebe等人在烟草上首次由原生质体培养获得植株。至今已获得酶法制备植物原生质体操作方法。第十页，共二十九页，2022年，8月28日①材料准备：植物的幼嫩部分——幼叶、根、下胚轴，亦可用成熟叶。禾本科用愈伤组织。②材料预处理：叶片萎焉处理——日光下2－8小时叶片预培养——如羽衣甘蓝诱导愈伤组织培养基培养7天后预先质壁分离——糖溶液中质壁分离第十一页，共二十九页，2022年，8月28日③酶解

纤维素酶类（Cellulase）果胶酶类（Pectolyase）半纤维素酶类（Hemicellulase）崩溃酶蜗牛酶第十二页，共二十九页，2022年，8月28日

原生质体分离常用的商品酶酶来源生产厂家纤维素酶类onozukaR–10绿色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果胶酶类MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲酶RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USAHemicellulase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,USA

第十三页，共二十九页，2022年，8月28日纤维素酶——从绿色木霉中提取。用于活力不同：P1500、P5000、OnozukaR-10（常用）果胶酶（离析酶）——从根霉、黑曲霉中提取。浓度若超过2％，分离时间过长，均易产生毒害。常用(MacerozymeR-10)。半纤维素酶－从黑曲霉中提取。常用于从愈伤组织中分离原生质体；常用RhozymeHP-150；蜗牛酶——分离孢粉素、胼胝质。第十四页，共二十九页，2022年，8月28日步骤：二步法：离析酶→纤维素酶一步法：复合酶处理优点：可获得大量的原生质体，几乎适用于所有植物的器官、组织和细胞。缺点：酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、酚类等物质，影响原生质体的活力。第十五页，共二十九页，2022年，8月28日注意事项：

⑴酶溶剂及其渗透压酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等浓度范围450～800mmol/L

⑵酶处理：酶浓度酶解时间酶解温度

第十六页，共二十九页，2022年，8月28日图示：原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶第十七页，共二十九页，2022年，8月28日三、原生质体的纯化材料在酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤压叶片，使原来组织中的原生质体释放出来。此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必须除去。第十八页，共二十九页，2022年，8月28日三种方法离心沉淀法漂浮法界面法第十九页，共二十九页，2022年，8月28日①离心沉淀法原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质体沉于底部。步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步离心（500～1000rpm,离心5～6min）。第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心沉淀。如此2～3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。第二十页，共二十九页，2022年，8月28日②漂浮法原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液培养基的界面上。第二十一页，共二十九页，2022年，8月28日③界面法500mmol/L蔗糖140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇+原生质体第二十二页，共二十九页，2022年，8月28日Protoplastcultureandfertilegreenplantregenerationofrye.a

Friableembryogeniccalli,b

suspensioncellaggregates,cfreshlyisolatedprotoplastsfromsuspensionculture,d

protoplastsstainedwithFDA,e

divisionofcellderivedfromprotoplasts,f

cellcoloniesderivedfromprotoplast,g

proto-callidevelopedfromprotoplastsembeddedinagarose,h

greenshootformation,i

fertilegreenplant第二十三页，共二十九页，2022年，8月28日a:firstdivision,10daysafterprotoplastisolationb,c:2and3womicrocolonies.d,e:4and6womicrocallif:8womicrocallijustbeforebeingtransferredontoB5

mediumabcdef第二十四页，共二十九页，2022年，8月28日ihgRecoveryofplantletsthroughsomaticembryogenesisg:TransferofmicrocalliontoB5

mediumandinductionofsomaticembryos.h:TransferofglobularembryosontoB5mediumformaturationofsomaticembryos.i:TransferofcotyledonarystageembryosontoMSmediumforconversionofembryointoplantlets.第二十五页，共二十九页，2022年，8月28日四、原生质体培养研究进展第二十六页，共二十九页，2022年，8月28日膜片钳技术

1976年[1]德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patchclamprecordingtechnique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术（genecloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。第二十七页，共二十九页，2022年，8月28日非对称细胞融合技术

所谓非对称细胞融合技术，即利用某种外界因素(常为γ射线，即γ融合gamma-