有机酸工艺学-其它有机酸发酵工艺-衣康酸

第三章其他有机酸发酵工艺学第一节衣康酸的发酵生产1.衣康酸发酵研究历史

2.衣康酸的性质和用途3.衣康酸生产的原理和微生物育种

4.衣康酸生产方法工艺5.衣康酸的提取工艺

第一节衣康酸的发酵生产1、衣康酸发酵历史和应用概述衣康酸(Itaconicacid)又称为甲叉丁二酸、亚甲基琥珀酸最早是由Baup于1836年在研究柠檬酸175℃的热分解产物时发现并得到的。

20世纪1929年代，日本学者木下广野盐水浸渍的酸梅汁中分离出一种能耐高渗透能利用蔗糖、葡萄糖产生衣康酸的青绿色曲霉，并定名为衣康酸曲霉（Asp.itaconicus）20世纪1939年代末，Calam、Oxford和Ratajakk等人先后报道了利用土曲霉（Asp.terreus）为菌种将葡萄糖发酵生成衣康酸。1945年。Lockwood分离出了适合表面培养的土曲霉265(Asp.terreus265)，对糖转化率达30%～50%,土曲霉NRRL1960(Asp.terreusNRRL1960)既适合表面培养又适应液体深层发酵

转化率47.3%。1948年Pfizer公司以蔗糖为原料液体深层发酵生产衣康酸，发酵两周，产酸32.4g/L,糖酸转化率45%。1955年，建立全球第一条以蔗糖为原料发酵衣康酸生产线。1970年10月，日本静冈县磐图化学公司建立了一座年产1000t衣康酸的工厂，成为当时最大的衣康酸生产公司(该公司目前生产能力为1500t／a。1977年，日本筑波大学应用化学系宣布以木屑水解液为主要碳源，采用土曲霉K26为菌种发酵制备衣康酸获得成功，其产量达4.75％，对糖转化率最高可达54.9％20世纪80年代以来．衣康酸的研究得到迅速发展，更多的微生物如假丝酵母M31、黑曲霉P-1等被发现能够产生衣康酸。Horitsu等用聚丙烯酰胺凝胶包埋土曲霉生产衣康酸．在连续的发酵柱中产酸速率为60mg/h。H．Kautola等以海藻酸钙凝胶包埋土曲霉NRRL1960的孢子或用CeliteR-626琼脂凝胶块固定化菌体，在间歇深层发酵中最高葡萄糖转化率为54.5％，容积产率是0.32g／(L·h)；居乃琥、王孝宪采用固定化土曲霉NRRL1960，以葡萄糖为原料连续发酵．利用交替接触空气和液体的固定化细胞生物反应器连续生产衣康酸，最高容积产率为0.73g／L·h，最高衣康酸质量浓度为18.2g/L。到20世纪90年代末，我国已有10多家衣康酸生产厂。我国衣康酸产业化体系初步形成。1992年，云南天力生物发酵厂宣布建成国内首条年产300t衣康酸生产线。1994年该厂又在此基础上建成年产2000t衣康酸生产线，以蔗糖为原料，在300m3气升式发酵罐中产酸50g/L以上，对糖转化率大于50％，收率60％，发酵周期50h。四川成都拉克公司、浙江江山国光生化科技有限公司、广东雷州衣康酸公司，山东青岛琅琊台集团有限公司，山东济南华明生化有限公司

成都拉克生物工程实业有限公司年产2500吨衣康酸、120吨曲酸的工业生产能力浙江江山国光生化科技有限公司、生产规模衣康酸6000吨/年、饲料级L-苏氨酸5000吨/年。山东青岛琅琊台集团有限公司青岛科海生物有限公司，衣康酸1万吨、葡萄糖酸钠5万吨生产能力山东济南华明生化有限公司衣康酸15000吨/年，葡萄糖酸钠20000吨/年2017年全国衣康酸产量5万吨。

2衣康酸的性质和用途2.1衣康酸的性质衣康酸是一种不饱和二元酸，分子式为C5H6O4,分子量为130.1，结构式为：纯衣康酸是一种白色粉末状结晶或无色晶体，熔点167~168℃结晶产品不易吸潮，即使在高温条件下也不结块，在真空条件下加热升华。易溶于水和其他有机溶剂。衣康酸的部分物理化学性质性质数值性质数值熔点℃167~168燃烧热MJ/moL1.98晶体密度Kg/m31.49±0.01生成热KJ/moL840相对密度Kg/m31.63毒性（LD50）mg/Kg4000水中解离常数K1=1.50×10-4K2=2.20×10-6衣康酸在水中的溶解度温度℃溶解度（g/dL）温度℃溶解度（g/dL）105.95029.2208.36045.9259.57072.62812衣康酸由于分子内存在一个不饱和双键和两个活泼的羧基，使其能够发生很多化学反应，其中最重要的是衣康酸的酯化反应。标准的酯化反应能够产生衣康酸二酯，且产率很高，衣康酸可以和丙烯酸以不同的比例，于80～200℃的水性介质中共聚可以制得分子量在500～2,000,000之间的共聚物。衣康酸分子内的双键可以和卤素起定量的加成反应，是测定衣康酸的基础。衣康酸和胺类反应生成的N-羟基吡咯烷酮是重要的化合物。衣康酸的同分异构体衣康酸有两种同分异构体，即柠康酸和中康酸，在酸性、中性和弱碱性条件下，衣康酸是稳定的。但在强碱性条件下，3种异构体可以相互转化。2.2衣康酸的用途

2.2衣康酸的用途

（1）衣康酸和丙烯酸共聚物的应用以衣康酸和丙烯酸共聚生成的乳胶可用于皮革的涂层，增加皮革的可塑性，作为汽车、电器涂料，粘着力加强，色泽美观，不易受外界条件的影响，加入多价金属氧化物交联的衣康酸和丙烯酸制成的牙科粘和剂具有良好的抗压性能和黏结强度及生理适应性。以不同比例的衣康酸，丙烯酸共聚物可制备多种不同用途的聚合物，如无菌食品包装材料等。（2）新型高效除臭剂的应用分子内活泼的双键和两个羧基，可以与氨，胺类等碱性恶臭物或硫化氢等酸性恶臭物反应，达到除臭的目的。（3）在药物合成中的应用衣康酸与甲苯胺环缩反应，再用甲醇酯化制成1-(4-甲苯基)-5-氧-3-吡啶羧酸甲酯，在氢硼化钠作用下生成经甲基衍生物，再用甲基磺酰氯酯化生成甲磺酰酯，进一步用苯甲酸酯进行醚化、皂化、脱酯化等系列反应，可制成4·[11甲基苯基-2-吡咯烷酮-4-基]-甲氧基苯甲酸。该品在生物体内与辅酶A酯化，有极强的抑制胆固醇合成酶和脂肪酸合成酶的作用，从而抑制人体内的脂肪酸和胆固醇的合成，是预防相治疗动脉硬化、糖尿病等多尿病和肥胖病的新药（4）在纺织行业的应用无水衣康酸可与蚕丝蛋白中的丝氨酸和羊毛蛋白中赖氨酸、精氨酸及酪氨酸分子反应形成直链化合物，对纤维本身无不良影响，可大大改善蛋白质纤维的防皱性、耐热性和热稳定性，而吸湿性显著降低。（5）在造纸行业的应用聚丙烯酰胺称为标准造纸助剂，衣康酸作为阴性单体合成的聚丙烯酰胺除了可以作为助滤剂以外，还可以作为纸张增强剂，与使用普通的纸张增强剂相比，能够使纸张强度获得较大程度的提高，且纸张均匀平整，品质优良。与丁苯乳胶配制成新型水溶液，用具有较强支持力的白土等作为填充剂，能与纸张形成牢固的膜层，可使纸张变得强韧，并对油墨具有很强的粘着力，使印刷出来的图案鲜艳美观。（6）在其他行业的应用

衣康酸二双烷共聚体作为原油的流动点下降剂、可使原油流动温度由24℃下降至1℃；衣康酸与月桂酸—氨乙基乙醇胺的缩合反应生成咪唑啉衍生物．是生产化妆品的有用试剂；衣康酸与芳香二胺生成的吡咯烷酮衍生物是润滑剂和增稠剂；与其他各种胺生成的吡咯烷酮衍生物可用于洗涤剂、医药和除草剂之中。衣康酸及其酯类具有广泛的用途，是化学合成工业的重要原辅材料．也是化工原料生产中的重要中间体，具有广泛的开发前景。国外衣康酸的消费构成

用途比例%树脂行业53化纤行业17.8离子交换树脂8锅炉清洗剂1增塑剂7牙科材料、人造宝石、特种透镜10.2时间20112013201520172019需求量（万吨）8.729.9511.4313.0514.982011~2019年世界衣康酸产量情况3衣康酸生产的原理和微生物育种

3.1.发酵原理衣康酸生物合成途径已有很多研究，由于研究的菌种、培养方法、检测手段和分析角度不同，所得的结论也不完全一致。所以衣康酸的生物合成机理至今尚无统一的看法。Bentley等认为，葡萄糖经糖酵解(EMP)途经和三羧酸循环(TCA)合成柠檬酸之后．再脱水脱羧生成衣康酸；也有人认为可能直接由乙酰CoA和丙酮酸合成柠苹酸，再由柠苹酸失水而生成衣康酸；上述两条途径实际是交叉的，第一条途径到柠檬酸时可脱羧形成柠苹酸而走第二条途径。因此总的反应式都为：对糖的理论转化率为72%3.2发酵微生物

能产生衣康酸的微生物种类：土曲霉(Asp.terrus)、衣康酸曲霉(Asp．Itaconicus)假丝酵母(Candidaspecies)、红酵母(Rhodotrorula)、黑粉菌(Ustilagojeae)、桑卷担菌(Helicobasidiummompa)查尔斯青霉(Penicillumcharlesii)黑曲霉(Asp.niger)。工业化生产菌株1955年，美国Pfeifer公司首次实现了衣康酸的工业化生产。到目前为止，用A.terreusDSM23081发酵生产衣康酸获得了高产量86.2g/L、高产率0.62g/g和高生产强度和0.51g/L·h。衣康酸生产菌诱变选育生产衣康酸的微生物筛选法：（1）形态筛选法根据以往育种工作的经验，对突变菌落的形态有针对性地筛选。(2)指示剂显色法，将诱变株移植在合有0.01％溴甲酚绿指示剂的琼脂平板上培养，根据透明圈直径的大小来筛选突变株。(3)“浓缩”过滤筛选法将经诱变的细胞悬浮液移于以衣康酸为惟一碳源的合成培养基中，30-37℃静置培养18～24h经曲层薄宣纸过滤，滤去菌丝，滤液经稀释后在琼脂平板上分离、筛选。这种方法的主要目的是筛选不能利用衣康酸的突变株，从而提高衣康酸产量。(4)标记筛选法有的科研人员在含1％LiCl抗性平板中筛选出优良的菌株。也有人利用单氟乙酸为乌头酸水合酶的专一性抑制剂，在单氟乙酸抗性平板中挑选出的菌落乌头酸水合酶活性较高，从而获得高产衣康酸菌种。4、

衣康酸生产方法工艺4.1化学合成法美国Pfizer公司和日本电气化学公司曾经研究开发以丁二酸酐或丁二酸酯为原料，以不同的催化剂与甲醛反应生成柠康酸，在加热异构化得到衣康酸。美国Pfizer公司以柠檬酸为原料，在480℃汽化，喷雾进料，以负载的磷酸盐为催化剂，在290～340℃反应得到柠康酸，转化率达82%，然后加热220℃异构化得到衣康酸。英国人Calsson等以柠檬酸为原料在250℃高温，34.5Mpa高压下反应生成衣康酸和柠康酸，反应的总选择性超过了90%。4.2发酵法生产

4.2.1液体深层分批发酵工艺

（1）液体深层批发酵的工艺流程（2）液体深层发酵衣康酸中重要的工艺参数包括

培养基---碳源初始糖浓度氮源类型及其浓度对衣康酸发酵影响氮源种类氮源浓度/g.L-1衣康酸产量/g.L-1菌体量/g.L-1(NH4)2SO4172.410.5278.611.5380.411.4482.711.9582.011.8NH4NO3178.211.2284.011.4383.111.4481.711.0579.411.3尿素148.27.1247.27.2348.97.4446.17.6545.47.6（2）液体深层发酵衣康酸中重要的工艺参数包括温度，pH，接种量，通气与搅拌速度温度：土曲霉对温度极为敏感，不但会影响衣康酸的积累，而且还会导致产杂酸。土曲霉孢子培养温度以(36±1)℃最佳；一、二级种子培养温度以36℃为宜，pH:pH对最终衣康酸的产量起着十分重要的作用。pH在1.8以下时，土曲霉几乎不能生长和产酸；pH在4.5以上时．菌丝形成较大菌丝球．有时直径可达5～6mm，同时几乎不产酸。在菌体生长高峰期应维持pH在3.0左右，以获得最大生长速率；一旦进入产酸期，应控制pH在2.1～2.3范围内。接种量一级种子接种量保证培养液内孢子数达108～109个／mL为宜，二级种子接菌丝悬浮液12％～14％。通气量在生产中如果通气不足，则严重影响产酸速率及转化风量750L罐，0.25m3/m3.h,转速80~90r/min.（2）固定化细胞发酵工艺60年代，Kobayashi提出了固定化技术连续生产衣康酸的发酵工艺。尤其是进20年来，利用包埋法固定衣康酸生产菌的全细胞生产衣康酸技术的研究比较活跃，固定化土曲霉菌体细胞使用的载体多为聚丙烯酰胺凝胶。1983年Horitsu等人报道了用聚丙烯酰胺凝胶固定土曲霉细胞生产衣康酸的方法，将固定化后的凝胶切成4mm3的碎块，取40g凝胶装入和间歇发酵同样的反应柱，采用流速4ml/h，35℃通气1.4L/min连续发酵15天后，衣康酸产生速率达到60mg/h,固定化细胞半衰期为10天。1986年我国居乃琥等人报道了利用多孔转盘式反应器培养固定化土曲霉菌生产衣康酸的方法。使用的菌种为NRRL1960,在36℃，pH3.0，转盘转速8r/min,通气100ml/min的条件下连续发酵，流加速度在60ml/h时，衣康酸的产生速率达0.73g/L.h。但到目前为止，固定化细胞发酵工艺生产衣康酸的技术还仅限于实验室研究，尚无工业化生产的报道（3）补料分批发酵工艺根据衣康酸发酵过程底物消耗速率和代谢产物合成的关系，可以找出补料发酵的规律。例如Asp.terreus54-S-30，在200L气升式反应器中发酵，在36～65h阶段，衣康酸发酵进入产酸期，在此阶段，衣康酸的容积产率维持在2.3g／(L·h)，糖的消耗速率也恒定在3.9g／(L·h)，糖酸转化率维持在60％。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液底物浓度较长时间保持在一定范围，达到延长产酸期的目的。从而提高容积产率、产物浓度和得率。4.1.5衣康酸的提取工艺

4.1.5.1浓缩结晶法主要工艺步骤概括为：发酵液预处理，脱色过滤，浓缩，结晶和重结晶，干燥等几个步骤。①发酵液预处理一般加热温度为70～75℃；维持15min，可以杀死菌体，防止衣康酸被分解代谢，使蛋白质等菌丝体物质变性凝固，有利于过滤；同时使菌体中的衣康酸释放出，以提高收率。衣康酸浓度达15％以上时，为了防止衣康酸结晶，必须对过滤设备进行预热和保温50℃。②脱色过滤过滤主要是利用压力差为推动力来达到固液分离的目的。在衣康酸生产中通常使用粉状活性炭，也可使用颗粒活性炭及脱色树脂进行脱色。脱色过滤与发酵醪的过滤有所不同，一是活性炭易穿滤和堵塞滤孔．所以在过滤前必须加入与活性炭等量的助滤剂，以加强过滤效果。常用的助滤剂为硅藻土；二是衣康酸浓度达15％以上时，为了防止衣康酸结晶．必须对过滤设备进行预热和保温。③浓缩在常温下水溶液(或滤液)中衣康酸浓度较低．容易被微生物分解，所以应立即浓缩，不宜停留时间过长。在浓缩过程中温度不能过高，若在高温下长时间加热，衣康酸会发生部分分解或可能被破坏而变性；同时，残留在溶液中的其他有机物在高温下也易分解，使浓缩液色泽加深，粘度增加造成结晶困难，从而影响产品质量。浓缩过程中真空度一般要在0.087MPa以上，料温不超过70℃。蒸汽压力控制在0.2MPa以下，放料时酸度达40％～45％。④结晶及分离用10℃以下冷冻水降温，控制温度在40℃以下结晶。可加入筛选好的晶种促使结晶。8~12小时后，温度下降至15℃以下进行离心分离125~130r/min.⑤干燥衣康酸的干燥是为了去除在晶体表面的游离水，一般70℃沸腾干燥。4.1.6衣康酸质量标准

关于衣康酸的标准目前只有行业标准，中华人民共和国轻工行业标准QB/T2592-2003项目指标优级一级含量，%（质量分数）≥99