实验二培养材料消毒和接种

实验二培养材料消毒和接种第一页，共二十五页，2022年，8月28日一、实验目的1、掌握植物组织培养中的无菌操作技术2、掌握植物外植体表面消毒的常规方法第二页，共二十五页，2022年，8月28日操作前的准备工作接种室在接种前4-5d必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全面消毒，一般用40%福尔马林进行全面喷雾，并密闭24h，然后打开换气窗10-15min.。

第三页，共二十五页，2022年，8月28日A:实验器具和材料的准备

B:用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。

C:关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）

第四页，共二十五页，2022年，8月28日D:用70－75％乙醇消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。

注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。

第五页，共二十五页，2022年，8月28日接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中

错

误

第六页，共二十五页，2022年，8月28日整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速

正

确

错

误

第七页，共二十五页，2022年，8月28日接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染

正

确

错

误

第八页，共二十五页，2022年，8月28日培养器材的清洗与灭菌在细胞工程实验中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物和细胞残余物以及非营养的化学物质。某些化学物质仅0.01μg/L就会对细胞产生毒性作用，因此对培养器皿的清洗是组织培养中一项极为重要的环节。第九页，共二十五页，2022年，8月28日A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃烘箱内烘干备用。

第十页，共二十五页，2022年，8月28日B、使用过的玻璃仪器的清洗

先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗.C、金属用品洗涤

金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥

第十一页，共二十五页，2022年，8月28日（1）干热灭菌

适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150℃、40min（2）湿热灭菌

适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121℃维持20~30min

第十二页，共二十五页，2022年，8月28日（3）过滤灭菌培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素。第十三页，共二十五页，2022年，8月28日（4）射线灭菌

主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20-30min。

注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机、（5）火焰灼烧灭菌

用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。

第十四页，共二十五页，2022年，8月28日（6）消毒剂

适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。

几种常用消毒剂的效果比较消毒剂使用浓度(%)消毒时间(min.)效果残液去除难易乙醇70-750.1-3好易新洁尔灭10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最难过氧化氢10～125～15较好最易抗菌素4～50mgl-130～60较好较难次氯酸钙/纳9～105～30好易第十五页，共二十五页，2022年，8月28日二、实验原理用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进行消毒。从室外取的材料，一般先用自来水冲洗数分钟.第十六页，共二十五页，2022年，8月28日接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤3～5遍，最后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两种消毒剂交替浸泡法。第十七页，共二十五页，2022年，8月28日一般，首先用75％乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min或含有2％活性氧的次氯酸钠溶液5～30min，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌3～5min，无菌水漂洗3次后，切割、用于接种。

消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。

第十八页，共二十五页，2022年，8月28日三、实验材料器材：超净工作台、镊子、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。药品及材料：0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、绿豆种子、培养基。第十九页，共二十五页，2022年，8月28日四、实验步骤（1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。（2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，照射至少20分钟，关闭台内的紫外灯，通风五分钟后，再开日光灯进行无菌操作。（3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。（4）将绿豆种子在流水下冲洗干净。第二十页，共二十五页，2022年，8月28日（5）将种子放于广口瓶中，用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗，然后用0.1%升汞溶液浸泡3、5、10min，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。（6）取出培养皿，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把皿表面擦一下。第二十一页，共二十五页，2022年，8月28日（7）接种用的镊子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。第二十二页，共二十五页，2022年，8月28日（8）在酒精灯火焰旁揭去培养皿封口膜，在靠近火焰处，右手用灭菌的镊子夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放8-12个外植体。（9）封上封口膜，标上接种日期、材料名称、姓名等，将接种材料移到培养室培养。第二十三页，共二十五页，2022年，8月28日第二十四页，共二十五页，20