分子生物学实验的常见问题与解决方案

一、Southern杂交问题1：电泳后觉察凝胶中DNA集中，导致结果难以确定，如何解决这一问题？〔〕在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶准时处理使凝胶枯燥〔2〕解释。问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何抑制？,24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶根本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向全都,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特别的仪器,转移速度较快,转移效率高。利用地高辛标记探针进展Southern15kb的DNA进展脱嘌呤可以促进转膜效率,但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的DNA被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。假照试验转膜过程中同时含有大于15kbDNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半局部浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断DNA的转移效率，又不会打碎小片段DNA。步骤如下：1.(WAP)5’调控区指导人G-CSF基由于构件，建立转基因小鼠。转基因小鼠的检测承受剪取鼠尾DNA做Southern进展鉴定。2.琼脂糖凝胶直接杂交 l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。(3)干(4)将胶放人杂交液(6×SSC5×Denhardt’S、0.25%SDS、100μg/mlDNA)，加人探针，4216-20小时。(5)杂交完成后，洗8轮，4215分钟。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗两次，在冰水中浸泡2分钟，以利于盐的排出。(6)枯燥后按检测试剂盒操作，室温压片0.5-2小时。冲片照相。使用的探针为G-CSF。DNA，探针标记承受Fluorescein-12-dUTP，检测试剂盒为杜邦公司产品，操作按试剂盒说明书进展。用琼脂糖凝胶直接杂交的方法，较好地解决了微量核酸或低拷贝数转基因的检测问题，结果不仅直观，而且特异性好。与常规的Southern杂交相比，它所具有的优势是，它省略了将DNA进展转膜DNA一方面，也使简单的Southern杂交操作程序大大简化。因此，在转基因鼠的鉴定中以及微量核酸检测、疾病诊断中是防止低拷贝数基因漏检的一种可行途径。问题3：在向下转膜法中，如何提高转膜效率？解决方案：1、转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。假设转移液的水平面高于凝胶，短响纱布的吸水力，转移效率下降。2、吸水纸吸水后易变形，使吸水纸与滤纸间产生空隙，3、过夜转移时，准时添加转移液，防吸干。41DNA的残留，当样本丰度低时，以延长转移时间。5、纱布上不要加盖重物，防凝胶受压变薄，响转移效率。问题4碱转移完毕后的尼龙膜潮湿不利于保存，且防止长期保存过程中DNA结合不严密影响杂交效果，应如何做？DNA12023J交联4min4℃下保存备用但存放时间不宜超过半年。问题580%-90%的探针难以洗脱，如何解决这一问题？解决方案：将煮沸的5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷却至室温,可除去膜上已杂交的DNA探针。洗脱后的尼龙膜,可反复用于其他探针的杂交(5轮杂交与洗脱)。问题6：Southern杂交中，探针的背景高，应如何解决？解决方案：用随机引物法标记的探针要想得到最低的背景，在向尼龙膜上加prob-DIGEasyHyb混合物前,要用0.45μm异性结合到膜上；太低，敏感性会降低。利用地高辛标记探针进展Southern杂交时，以下2种措施可降低背景：(1)适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；(2)掌握地高辛抗体的浓度。使用足够量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号,但过量的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点。问题7：Southern杂交没有检测出出杂交信号的缘由，如何解决？1〕目的DNA在总DNA中所占的比例，一般需要10μgA,假设样品中目的基因含量较高,可以按比例削减DNA,致使常规的基因组用量不能满足Southern此时可加大基因组的用量〔2〕探针的0.2ml/cm2的杂交液；使用圆筒状瓶子进展杂交可以使用较小的体积，约0.1ml/cm2〔3〕DNADNA间的配〔见问题，3〕二、蓝白斑筛选问题1：做蓝白斑筛选只见白斑，不见蓝斑，该如何做？解决方案1IPTG和X-galLB琼脂37174℃两小时，蓝色会加深。基或者接入的菌种，再次培育，确保空白比照结果正确〔2〕假设空白试验结果正确，用牙签挑取白色菌落，进展PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白比照。阳性比照为经测序确认含有一样大小插入片段的重组菌落菌落，空白比照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性条带分析，确定是否重组，即PCR2μl6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的10加样孔中，200VEB30min，最终在紫外灯下数码照相。比对结果，推断白斑是否为重组子。问题2：做蓝白斑筛选时，只见蓝斑，不见白斑该如何做？解决方案1IPTG和X-galLB琼脂37174℃两小时，蓝色会加深。观看比照的蓝色是否和试验组的颜色一样没有阻断lacZ〔2〕用牙签挑取浅蓝色菌落，进展PCR扩增，同时设立阳性、阴性和认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白比照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性条带分析，确定是否重组，即PCR2μl6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的10％非变性加样孔中，200V电压电泳后，取胶至EB液中染色30min，最终在紫外灯下数码照相。比对结果，推断浅蓝色菌落是否为重组子。三、外源基因在大肠杆菌的表达问题但降低产生大量不具有生物活性的产物，如何降低包涵体的形成？〔1〕承受胰胨〔2〕培育液中参加甜菜碱和山梨醇来转变渗透压，使表达产物由包含体形式转变为活性状态，将温度从37℃降低到25℃时诱导表达，可降低包含体的形成〔3〕选用pMBI衍生而来的载体质粒，由于其可以协同表达DnaK-DnaJ或GroEL-GroES，增加分散蛋白的溶解度。分子伴侣折叠作用效率与细胞DnaK-DnaJ和GroEL-GroES的浓度有关，与表达蛋白的性质有关。2lac、tacIPTGlac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG，应如何做？1〕lac和tac启动子的转录受温度严紧调控：把阻遏蛋白LacI的温度敏感突lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lactac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度〔30℃〕时抑制，在较高温度〔42℃〕〔2〕用乳糖替代IPTGlactacΒ-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的lPTG作为诱导剂的争论要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。问题3：T7表达系统表达目的基因的水平是目前全部表达系统中最高的，但也不行避开消灭在相对较高的本底转录，假设目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。T7T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通显影响。问题4：为了提高外源基因的表达水平，对表达载体如何进展改进？解决方案：(l)可诱导拷贝数的表达载体。质粒的拷贝数由培育条件掌握，当需要增菌培育时，质粒的拷贝数很低，每个细胞仅1-5个拷贝，经适当条件诱导后，载体拷贝数可达每个100-500掌握拷贝数的表达载体，一类是基于质粒Rl根底上的单复制起始表达载体；另一类是双复制起始表达载体，一个复制起始来源于Co1EI，另一个来源于质粒pSC101。(2)多顺反子型SD序列插入在第一个顺反子的终止密码子TAAATG。由于第一个顺反子翻译地有效起始，使得大量的核糖体结合在多顺反子mRNA上，促进了核糖体对其次个顺反子的SD(3)带翻译增加子的表达atpE基因SDSD序列上游2-7bpatpEmRNA上核昔酸挨次为UUUUAACUGAAACAAA，将其插入到其它表达载体内构建的型表达载体，对Β-干扰素和IL-26-8倍。T7噬菌10mRNA16sRNA与翻译起始区的亲和力，将其插入SD序列上游或起始密码子下游均可提高翻译起始效率。问题5：质粒的过度增殖以及其后目的基因的高效表达影响受体细胞的生长代谢，导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。如何解决？〕类是基于质粒Rl根底上的单复制起始表达载体；另一类是双复制起始表达载体，一个复制起始来源于Co1E，另一个来源于质粒pSC10〔〕将外源基因插入到大肠杆菌的染色体chopinIGF-Iattλ位点，在不添加抗生素诱导的条件下，承受高密度发酵，IGF-I基因格外稳定。问题6：在分泌型异源蛋白的表达中，附加的甲硫氨酸也可能转变蛋白质的免疫性质和药理性质，应如何去除？解决方案：⑴在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵在分别纯化后在体外用外肽限制。问题7：把所表达的目标蛋白外泌到细胞外的培育基中可以进一步削减蛋白水解酶的降解，也有利于分别纯化。如何实现目标蛋白的外分泌表达？解决方案1与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达〔〕与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达3〕而且外泌效率一般都比较低。问题8：如何使外源基因高效表达？解决方案密码ATG与SD的变化对mRNA的翻译效率有显著影响，具体表现为：SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA3-6ATG与UAAGGAGG6-8个碱基长度，与AAGAA5-7个碱基长度；ATG与UAAGGAGG至少相隔3-4个碱基，与AAGAA5mRNA的翻译才能进展；ATGSD序列之间的碱基组成为A，T碱基丰富时，mRNA翻译效率较高。其次，尽量提高核糖体结合位点本身和四周的序列中A/TmRNA5’端形成的“茎环”构造的可能性，也是构建表达质粒时需要留意的事项。在必要的状况下，还可通过定点突变，PCR等技术转变个别关键的碱基来破坏mRNA5’端的“茎环”构造。把目标基因设计成多顺反子构造，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上其次个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’端序列简洁形成二级构造，而又不宜转变其序列的情形下。再者，在构建表达质粒时，充分利用各个基因的构造特征和特点，留意引入翻译增加子序列〔2〕共表达大肠杆菌稀有密码子tRNAtRNA的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA变。可承受1.通过基因突变把稀有密码子转变为其他使用频率高的同义密码子；2.在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度。〔3〕mRNA分子量较小的目标基因进展融合表达或串联聚合表达关心因子，如分子伴侣基因；对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进展改造；在较低的温度下培育菌体和优化发酵条件〔〕高密度发酵和工程化宿主细胞高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不行缺少的工艺步骤标基因的表达水平根本不变的前提下的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培育、流加补料培育、连续培育三种。工程化宿主细胞：1.构建出产乙酸力量低的工程化宿主菌是解决高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培育基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的缺乏导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用的根本途径提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透亮颤菌血红蛋白基因vgb导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度；用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因pta1和乙酸激酶基因ackA，使从丙酰乳酸合成酶基因alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶基因adh2导入大3-2.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因编码大肠杆RNA聚合酶的r32亚基，r32亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH基因缺陷的突变株己经被构建，争论结果说明它能明显提高目标基因的表达水平。问题比较长，我总结出来，大家可以很清楚的看到都有哪些问题1、Southern杂交2、蓝白斑筛选3、外源基因在大肠杆菌的表达4、PCR反响5、DNA的连接反响&细菌的培育6、southern杂交7、细菌的蓝白斑筛选法筛选转化子PCR反响假阴性，不消灭扩增条带可能缘由：模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丧失过多，或吸入酚，模板本身拷贝数低；⑤模板核酸变性不彻底。污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。酶失活性。需留意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。PCR失败或扩增条带不抱负、简洁弥散的常见缘由。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高浓度低，造成低效率的不对称扩增，OD值，更要留意引物原液做条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引不够引物之间形成二聚体等，需重设计引物。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。Mg2+1mM3mM0.5mM进展一系列反响，确定对于每个模PCR3mM5mM的镁离子浓度。反响体积的转变：通常进展PCR20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进展PCR扩增，是依据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，肯定要摸索条件，否则简洁失败。物理缘由：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能消灭与模板的结合而降低PCR扩增效率。PCR温度，有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延长温度。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性：消灭的PCR扩增条带与目的靶序列条带全都，有时其条带更整齐，亮度更高。可能缘由：引物设计不适宜：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进展PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，简洁消灭假阳性。对策：需重设计引物。靶序列或扩增产物的穿插污染：这种污染有两种缘由：一是整个基因组或大片段的穿插污染，导致假阳性。高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反响管和试剂用紫外线照耀，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有肯定的同源性。可相互拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。对策：可用巢式PCR方法来减轻或消退。消灭非特异性扩增带PCR扩增后消灭的条带与估量的大小不全都，或大或小，或者同时消灭特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的消灭，其缘由：〔1〕引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体〔2〕Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR〔3〕酶的质和量，往往一些来源的酶易消灭非特异条带而另一来源的酶则不消灭，酶量过多有时也会消灭非特异性扩增。模板量，削减循环次数。④适当提高退火温度或承受二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延长)。⑤降低Mg2+浓度。消灭片状拖带或涂抹带可能缘由：酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多。对策：①削减酶量，或调换另一来源的酶。②削减dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，削减循环次数。RT-PCR反响在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物可能缘由：RNA被降解RNA，使用良好的无污染技术分别RNA；②在将组织从动物体取出后马上处理在100％甲酰胺中储存RNA；③假设使用胎盘RNase45pH8.0，否则抑制剂或释放全部结合的RNase。而且，在≥0.8mMDTT时参加RNase抑制剂，肯定要存在DTT。RNA中包含逆转录抑制剂对策：通过乙醇沉淀RNA70％〔v/v〕乙醇对RNA沉淀进展清洗。可以参加0.25μg到0.4μg/μ以帮助小量样品RNA的恢复S甘油，焦磷酸钠，spermidine〕RNARNA反响比较产量以检验抑制剂。多糖同RNA共沉淀对策：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火对策：①确定退火温度以适合引物。对于随机六聚体，建议在反响温度保温之前先在25℃保温10GS，可以试一下其他GSoligo(dT机六聚体。③确定GSP是反义序列。起始RNA量不够RNA量。对于＜50ngRNA样品，可以在第一链cDNA0.1μg到0.5μg乙酰BSA。RNA模板二级构造太多对策：①将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。②提高逆转录反响温度，对SuperScripⅡ可以到5ThermoScript可以到66℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反响温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反响温度≤6℃。不要在高于3℃时使用M-ML。③假设不需要全长cDN随机引物。引物或模板对剩余的RNA模板敏感对策：在PCR前用RNaseH处理。靶序列在分析的组织中不表达对策：尝试其他靶序列或组织PCR没有起作用对策：对两步法RT-PCRPCR1/5的逆转录反响产物。污染造成假阳性可能缘由：样品间的穿插污染对策：①收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于180℃的高温下60.5%次氯酸钠消毒后再翻开紫外灯照耀半小时。RT-PCR本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器及其它溶液被污染。RT-PCR试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进展台面消毒和紫外线照耀消毒。扩增产物的污染，极微量的扩增产物污染就可造成假阳性。对策；每次试验完后，扩增产物都要准时密封后处理。设阳性比照。操作人员污染：只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，从而影响结果的准确性，RNA酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，简洁造成试验失败。对策；操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套，试验过程中手套要勤换。设置PCR操作专RT-PCR反响液、PCR循环扩增等步骤分室进展，试验前应将试验室及试验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNARNA。在无反转录酶的状况下，比照RNA获得扩增结果可能缘由；比照RNA中含有痕量DNA。对策：第一链cDNA1:10、1:100、1:1000倍以消退DNA污染所造成的影响。有可能是引物二聚体的条带。扩增产物滞留在加样孔中可能缘由：由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。100倍再进展二次扩增。另外，在二次PCR时使用的退火温度假设比引物的Tm5℃，可以将退火温度适当增高或进展热启动以提高特异性。定量PCR定量PCR无CT值〔信号〕消灭可能缘由：反响循环数不够35个循环以上，可依据试验状况增加循环〔45cycle，但高于45增加过多的背景信号。测荧光信号的步骤有误SG72℃延长时采集，Taqman法则一般在退火完毕时或延长完毕采集信号。引物或探针降解对策：可通过电泳检测其完整性。引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延长的状况。对策：重设计引物或探针模板量缺乏对策；对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解对策：避开样品制备中杂质的引入及反复冻融的状况。CT值消灭过晚可能缘由：扩增效率低，反响条件不够优化等。PCR各种反响成分的降解或加样量的缺乏PCR80-150bp的产物长度。标准曲线的线性关系不佳可能缘由：加样存在误差，使得标准品不呈梯度对策：准确操作。标准品消灭降解对策：避开标准品反复冻融，或重制备并稀释标准品。引物或探针不佳对策：重设计更好的引物和探针模板中存在抑制物，或模板浓度过高对策：降低模板浓度或重制备。阴性比照也消灭明显的起飞可能缘由：混合物或水被污染对策：避开污染。引物二聚体的消灭对策：用SG法在35cycles以后阴性消灭起飞属正常状况，可协作熔解曲线进展分析。反响过程中探针的降解对策：用电泳对探针进展检测。假设使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。熔解曲线不止一个主峰可能缘由：引物设计不够优化对策：应避开引物二聚体和发夹构造的消灭。引物浓度不佳对策：适当降低引物的浓度，并留意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高对策：适当降低镁离子浓度，或选择更适宜的mix试剂盒。模板有基因组的污染对策：RNA提取过程中避开DNA的引入，或通过引物设计避开非特异扩增。扩增效率低可能缘由：反响试剂中局部成分特别是荧光染料降解。反响条件不够优化对策：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反响体系中有PCR反响抑制物影响。试验重复性不好可能缘由：加样不准确对策：准确操作。仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差对策：应削减样品的稀释倍数。变性温度是否适宜DNA95°C9094°C都不能很好地变性DNA。由于局部变性，参与反响的探针和引物相应的削减了，因此反响效率会下降。变性时间是否适宜1520秒对于变性扩增子是足够了，然而，长一点的产物，可能会需要30秒，60秒的变性时间通常是不需要的。退火温度和时间是否适宜检查引物和探针的Tm值，SYBRGreenI2035秒，双标记探针通常是两456060°CFRET探2030秒。在哪一步骤采集信号SYBRGreenI72°C，此时绝大局部的DNA是双链状态，如上所述，双标记探针通常FRET检测，数据应当在退火检查程序设定是否存在至少一个的信号采集点。是否选定了适宜的增益值100荧光就到达了10SYBRGreenIFRET的样品可以在肯定程度上反复使用。DNA限制性内切酶酶切反响DNA完全没有被内切酶切割可能缘由：内切酶失活对策：标准底物检测酶活性。DNA不纯，含SDS、酚、EDTA等内切酶抑制因子。对策：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA条件不适〔试剂、温度〕对策：检查反响系统是否最正确。DNA酶切位点上的碱基被甲基化对策：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶，重将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株。DNA酶切位点上没有甲基化〔如DpnI〕对策：换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA〔San3AI代替DpnI)，重将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增。DNA位点上存在其它修饰对策：将DNAλDAN混匀进展切割验证。DNA不存在该酶识别挨次对策：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进展验证。DNA切割不完全可能缘由：内切酶活性下降对策：用5-10倍过量消化。内切酶稀释不正确对策：用酶贮藏液或反响缓冲液稀释酶。DNA不纯，反响条件不佳对策：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA；检查反响系统是否最正确。内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰对策：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶，重将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株；将DNAλDAN混匀进展切割验证。局部DNA溶液粘在管壁上对策：反响前离心数秒。内切酶溶液粘度大，取样不准对策：将内切酶稀释，增大取样体积。酶切后DNA粘末端退火655-10分钟，取出后置冰浴骤冷.由于反响溶液、温度、猛烈振荡使内切酶变性对策：使用标准反响缓冲液及温度，避开猛烈振荡。过度稀释使酶活性降低对策：适当稀释酶液，反响液稀释的酶不能贮藏。反响条件不适对策：使用最正确反响体系。识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸挨次对策：加大酶量5-10倍。DNA片段数目多于理论值可能缘由：内切酶星状活性对策：检查反响条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均可导致星状活性，降低酶的使用量。其它内切酶污染对策：用λDNA作底物检查酶切结果。底物中含其它DNA杂质对策：电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段。酶切后没有观看到DNA片段的存在可能缘由：DNA定量错误〔如RNA含量较高〕对策：用RNA酶A〔无DNA酶〕100ug/mlDNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量。在酶切反响液中形成非特异性的沉淀对策：在反响前透析DNA样品或用酒精沉淀二次。内切酶保存期内快速失活可能缘由：保存温度不适宜对策：内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存。以稀释形式保存对策：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用。贮藏缓冲液不适当对策：使用厂家推举的贮藏缓冲液。低蛋白浓度对策：内切酶与500ug/mlBSA一起保存。电泳后DNA片段的带型弥散，不均一可能缘由：DNA上结合有蛋白质655min0.1%SDS，酚/氯仿抽提纯化。内切酶中含有DNA外切酶对策：削减酶用量或消化时间，换用包装的酶。酶切后的DNA片段连接效率低可能缘由：含磷酸盐的浓度高对策：透析，乙醇沉淀去除磷酸盐ATPDNA。平末端连接对策：加大T4DNA连接酶的用量。外切酶污染对策：削减酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA。连接缓冲液不适宜对策：重配制连接缓冲液。DNA的连接反响TA克隆连接失败或效率低可能缘由：连接缓冲液活性低，ATP降解或缓冲液稀释不当对策：使用一次性分装的缓冲液，避开反复冻融。供给的T4连接酶缓冲液为十倍浓度，正确稀释。连接酶失活对策：更换连接酶PCR产物中含有抑制连接的成分，导致连接失败对策：将PCR产物和连接反响比照混合，观看是否存在抑制效应。如疑心有抑制成分存在，应重纯化PCR产物。PCR3’A突出端，不能连接3’A突出端的DNA聚合酶或平端PCR产物先通过聚合酶及dATP进展3’A突出端，再与T载体连接。载体T突出端丧失，引起载体平端连接对策：避开核酸外切酶的引入，降解T突出端。只使用无外源核酸酶的T4连接酶。插入片段与载体比例不抱负对策：优化比例粘端连接留意事项连接反响的温度：ＤＮＡ连接酶的最适反响温度为３７℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般实行提高ＤＮＡ的浓度，增加重除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反响后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。阳性克隆的筛选来确定。假设要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重连接酶切后的λDNA。假设连接成功，则说明有效。平端连接留意事项插入片断和载体片断的比例要高。连接酶要加的多点，最好用高浓度的酶。载体片断要做去磷酸化处理。15％的PEG8000来增加连接效率和削减载体自联。10UL，不要太大。去磷酸化的步骤要依据自己酶的性质而定，一般要反响一个小时，在反响半小时后再补充酶再反响半小时。插入片断和载体片断要酶切良好。低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反响。建议放14度好。用T4DNA连接酶连接后转化失败可能缘由：反响体系内无ATP或Mg2+对策：使用随酶供给的buffer或向其它兼容的bufferATPATPBuffer保1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核ATPATP，由于后者不起作用。反响体系中盐浓度过高或EDTA含量高对策：纯化DNA去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底对策：依据厂家推举的方法去除去磷酸化酶。DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA对策：保持总DNA1-10μg/ml之间。连接末端为单碱基突出末端5μl16°C过夜连接。插入片段和质粒没有磷酸化。留意：假设载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进展磷酸化。参加过多的连接混合物至感受态细胞对策：50μl1-5μl连接混合物。插入片段太大，不能进展环化对策：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。连接酶失活对策：用lambdaHindIII或其它可行的底物进展检测。内切酶酶切反响后，有什么因素可以导致T4DNA连接酶连接和后续的转化失败可能缘由：内切酶酶切不充分PCR6个保护碱基。用比照底物检测内切酶的活性。内切酶没有完全失活对策：假设内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。内切酶的星号活性消化了载体或插入片段对策：跑胶检测DNA，假设存在多余的条带，削减内切酶使用量或减短反响时间。DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端对策：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和留意事项，假设连接QC不佳或外切酶活性高，削减内切酶量或縮短反响时间。在应用快速连接试剂盒时，什么缘由可以造成不完全连接或转化？可能缘由：快速连接反响被热失活了，快速连接缓冲液中含有PEG，热失活后会抑制转化。PEG会阻挡电击反响。对策：应用商业化的DNA纯化柱纯化连接产物。PEG就会降低转化30min，也不会获得更好的效果。反响体系中盐浓度过高，抑制了连接或转化反响对策：纯化DNA。脱磷之后，所用的磷酸酶〔CIP，BAP或SAP〕没有完全失活或去除对策：可以依据推举的操作来进展以去除磷酸酶或者选用热敏磷酸酶NEB#M028655min即可完全失活而无需纯化DNA。细菌的培育用氨苄抗性的选择培育基筛选转化细胞时，平板上没有克隆，有一层白色的浆状物，不均匀，像一层菌膜。可能缘由：氨苄无效或浓度过低，操作中引入杂菌；质粒没有转进去。对策：重转化质粒，更换氨苄。工程菌的不稳定性及其对策关。重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有局部同源等都会造成质粒的不稳定。〔rec系统〕的完整性、重组时有关基因的具体变异等都有关系。在培育环境中高温、去垢剂〔如SDS等、某些药物〔如利福平、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丧失，因而常实行以下措施以防止或降低工程菌的不稳定性。组建适宜载体在质粒构建时，插入一段特别的DNA片段或基因以使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。选择适当宿主重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响，在选择酵母中较不稳定。施加选择压力从遗传学来说，选择即利用某些生长条件使得只有那些具有肯定遗传特性的细胞才能生长。在重组DNA技术中，有好几方面利用选择压力，如转化后用选择压方法消退重组质粒的不稳定，以提高菌体纯度和发酵生产率。①抗生素添加法②抗生素依靠变异法③养分缺陷法。掌握基因过量表达提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但很多—去阻遏启动子原理掌握基因过量表达，②选择温度敏感型质粒掌握基因过量表达。掌握培育条件重组菌所处的培育环境条件对其质粒的稳定性和表达效率等均具有很pH值范围，溶氧水平〔好氧菌成分、培育温度、菌体的比生长速率三个方面最为重要。southern杂交时如何提高消化效果？答：一般在消化完毕时可取5μl电泳检测消化结果。假设消化不好，可以延长消化时间，但6小时；或放大反响体积；或补充酶再消化。如仍不能奏效，可能是DNA样品中含有太多杂质，需要先进展提纯；或是酶的活力下降需要更换。Southern杂交的探针一般用什么标记？有哪些标记方法?答：进展Southern杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法。比照试验结果好，却没有回收到目的片段，试验出了什么问题？答：A〕连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。B〕插入片段带有污染，使3’-T缺失，或抑制连接，抑制转化。插入片段需纯化，或重制备。C〕插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照耀，时有发生。UV过度照耀会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重纯化。D〕高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如觉察插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株。进展一次成功的连接试验需要优化哪些试验指标？答：进展一次成功的连接试验需要优化一系列试验指标：8：11：163：11：3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一10-50ng的载体DNA。22oC保温4-1622oC34oC16小时。大多数连接反响用T4DNA连DNA当用pGEM载体克隆大片段时>7-8kb，经转化的菌株在30oC而不是在37oC生长，更有利于连接。为提高获得目的克隆的时机，应用完可能高转化效率的感受态细胞。D〕无杂质。残留的杂质会干扰连接酶的效果，抑制连接反响。蓝白斑筛选为什么没有白斑？lacZ留意连接酶不要是同尾酶；尝试更换反响缓冲液。在蓝白斑筛选中如何使显色更加明显？3712164度放几个小时，蓝斑显色更明显。蓝白斑筛选中消灭浅蓝色斑是怎么回事？30%的假阴性。比照组未导入含Amp抗性的质粒，涂布该大肠杆菌菌液，普遍都有大量菌落产生，这是怎么解释？基还没冷却时就加了氨苄，氨苄失效。影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应留意的事项有哪些？答：A〕细菌的生长状态：试验中应亲热注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞〔一般通过检测OD600α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/m；B〕全部操作均应在无菌条件和冰上进展；经CaCl224小时到达最高，之后转化率再下降〔这是由于总的活菌数随时间延长而削减造成的；Ca2〔如Mn2或Co2DMSO或复原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高100-1000倍；E〕所使用的器皿必需干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；F〕质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；G〕肯定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比。IPTG用于诱导lac、tac启动子的转录，但其本身具有肯定的毒性，假设用于医疗目的的重组蛋白并不适合。该如何解决这一问题？答：有两种解决方法〔〕把阻遏蛋白laⅠ的温度敏感突变株laⅠ(ts插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac、tac启动子的转录受到温度严谨调控，在较低温度〔30℃〕时抑制，在较高温度4℃〕〕用乳糖替代IPT制约，因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖代替IPTG作为诱导剂的争论要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。PL和PR表达载体由于菌体中没有cIPL或PR在一般大肠杆菌中相当不稳定。如何解决这一问题?答：方法之一是用溶源化λ噬箘体的大肠杆菌作为PLPR启动子表达载体的宿主菌；或cI857ts基因组装在表达载体上，这样就可以有更大的宿主菌选择范围。T7表达系统中本底转录水平过高的问题如何解决？答：解决这一问题的方法之一就是在表达系统中低水平表达T7T7溶菌T7RNA前T7溶菌酶基因都通过共转化质粒导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目标基因的表达水平没有明显影响。去除附加的甲硫氨酸有什么方法？答：在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因；分别纯化后在体外用外肽酶处理。转化的大肠杆菌为什么不长？答：A〕检查感受态细胞是否有问题，不管公司的也好自己做的也好，转化连接产物时同时转化一只质粒，作为比照。连接T的时候,效率很高，连接时间不是大问题。转化的细节处理：加培育基复苏：摇1h的话，可以多参加一些培育基，此时培育基肯定1h150rpm30min。D)涂板时来回轻轻涂布，感觉大多数地方都涂到即可,不要反复用力涂布,不要把涂布环或者涂布棒烧的过热,或者不待冷却就涂。切记感受态细胞比较柔嫩。E〕检查一下琼脂板是否有问题。F〕检查一下抗生素在配置过程中是否出错，有没有加错。如何增加蛋白在大肠杆菌中的表达？答：有以下几种方法〕摸索不同温度进展表达2〕提高诱导时间3〕建，对目的基因进展密码子优化〔4〕提高质粒稳定性〔5〕插入信号肽提高目标蛋白的稳定性的措施有哪些？1利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积存在周质空间或分泌到培育基中2〕承受缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌〔对分子量较小的目标基因进展融合表达或串联聚合表达〔5〕对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进展改造〔6〕菌体和优化发酵条件。1、Southern杂交做Southern用杂交袋还是杂交管〔瓶〕好？用不了多少杂交液，只需要几毫升，在杂交炉里旋转就可以保证膜均匀杂交。细菌基因组酶切后的条带可不行以用非变性聚丙烯酰胺凝胶来分别？然后再通过湿转印到尼龙膜上，一般要转印多久？文献上一般都是通过0.8%左右的琼脂糖凝胶来分别的，但是通过传统的毛细管法转印到膜上比较麻烦，琼脂糖凝胶上的DNA能通过半干转印仪来转印吗？Southern杂交目的就是要知道基因组中是多数DNA的迁移率与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成序列的影响，以致大DNA10%，所以非变性聚丙烯酰胺凝胶不能用来确定DNA的高，但需要仪器。毛细管转移虽然麻烦，但没有条件的状况下最好用，而且格外稳定，大小片段都能转得很好。Southern杂交的时候用什么来做标记比较好呢?除了放射性元素以外。答：非放射性标记系统主要包括三大类：半抗原类、荧光色素类、酶类。其中半抗原类使(biotin)、地高辛、荧光素、二硝基苯(dinitrophenyl)、雌二醇、香豆素等，前三者使用最为广泛，且均有商品化试剂盒选用。AmershamPharmacia公司开发的ECL系统为代表。它是在戊二醛的作用下将辣跟过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)染的可能。在这些系统中以的荧光色素类标记物最具潜力。非放射性系统的优势为：(1)安全、无污染、使用及后处理便利；(2)稳定性好，标记好的探极大便利；(3)利用几种不同的探针标记方法，可一次对同一样本进展多探针杂交。非放射性标记物进展方向为灵敏度高、稳定性好、试验周期短、检测方法简洁、安全。2、细菌的蓝白斑筛选法筛选转化子〔1〕蓝白斑筛选怎么都是白斑？900bp，TtakaraPMD18－T