纯培养与显微技术

纯培养与显微技术第一页，共六十二页，2022年，8月28日第二章纯培养与显微技术第二页，共六十二页，2022年，8月28日微生物的分离和纯培养

1.无菌技术

2.用固体培养基分离纯培养

3.用液体培养基分离纯培养

4.单细胞（孢子）分离

5.选择培养分离

6.二元培养物显微镜和显微技术

1.显微镜的种类及原理

2.显微观察样品的制备第三页，共六十二页，2022年，8月28日微生物个体：小利用群体研究属性群体形式繁衍、保存人为规定的条件下培养繁殖得到的微生物群体为培养物第四页，共六十二页，2022年，8月28日培养物纯培养物混合培养物纯培养能较好地得到重复结果，是微生物研究的重要技术之一第五页，共六十二页，2022年，8月28日显微技术是微生物研究的另一项重要技术个体小第六页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养无菌技术（aseptictechnique)

分离、转接、纯化时防止其他微生物污染的技术第七页，共六十二页，2022年，8月28日试管、烧瓶、培养皿等常用器皿灭菌方法有：高压蒸汽灭菌、高温干热、煮沸一、微生物的分离和纯培养微生物培养常用器皿及灭菌第八页，共六十二页，2022年，8月28日接种针或接种环分离或将微生物从一个培养器皿转接到另一个，无菌操作。火焰旁边、超净台或无菌室进行。接种环采用迅速加热和冷却的镍铬合金制备液体培养物用无菌移液管或移液器一、微生物的分离和纯培养接种操作，最基本技术第九页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养超净台火焰旁无菌区第十页，共六十二页，2022年，8月28日用固体培养基分离纯培养各种菌落一、微生物的分离和纯培养菌落(colony)：单个微生物在固体培养基或内层）生长繁殖形成肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞生长群体。菌落连成片为菌苔（lawn）第十一页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），是微生物分类、鉴定的重要依据。第十二页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养第十三页，共六十二页，2022年，8月28日同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落一、微生物的分离和纯培养第十四页，共六十二页，2022年，8月28日克隆（clone)：一个单细胞繁殖形成的菌落，即一个纯种细胞群或克隆。固体培养基：琼脂或其他凝胶物质固化的培养基。平板：即培养平板（cultureplate)。融化的固体培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板，用于分离、培养微生物。一、微生物的分离和纯培养第十五页，共六十二页，2022年，8月28日稀释平板法（pourplatemethod)

将细菌或其他微生物无菌水梯度稀释，取少量与冷却至50℃固体培养基混合，摇匀，倒入培养皿，凝固，倒置培养24小时，就会出现菌落。一、微生物的分离和纯培养常用固体分离纯培养方法：第十六页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养稀释平板法第十七页，共六十二页，2022年，8月28日涂布平板法（spreadplatemethod)

稀释平板法因为细菌与50℃培养基混合导致某些热敏感菌死亡，及好氧菌埋在培养基中缺乏氧气影响生长，所以更常用涂布平板法。一、微生物的分离和纯培养常用固体分离纯培养方法：第十八页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养涂布平板法第十九页，共六十二页，2022年，8月28日平板划线分离法（streakplatemethod）

接种环沾取少许微生物，在无菌平板扇形、平行等划线，随划线次数增加而分散开，得到单菌落。平板划线分离一、微生物的分离和纯培养第二十页，共六十二页，2022年，8月28日第二十一页，共六十二页，2022年，8月28日稀释摇管法(dilutionshakeculturemethod）厌氧微生物可用此法进行纯培养分离。操作：盛培养基试管加热融化，冷却至50℃，待分离材料用这些试管梯度稀释，摇匀，冷凝，石蜡封口一、微生物的分离和纯培养第二十二页，共六十二页，2022年，8月28日厌氧微生物分离装置：一、微生物的分离和纯培养厌氧罐厌氧手套箱第二十三页，共六十二页，2022年，8月28日液体培养基分离纯培养：一、微生物的分离和纯培养有些微生物液体培养基分离纯培养，原生动物、藻类。方法稀释法：接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个试管中分配不到一个。若稀释后同一梯度的平行试管中大多数（>95％）没有，那么有微生物的可能是纯培养，否则可能性下降。第二十四页，共六十二页，2022年，8月28日显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养获得纯培养一、微生物的分离和纯培养单细胞（单孢子）显微分离：稀释法缺点分离的优势菌显微操作仪，专业程度高第二十五页，共六十二页，2022年，8月28日对某微生物生长需要了解后，设计适合其生长繁殖的培养基，抑制其他菌生长，即使该微生物在混杂群体中很少也可分离。一、微生物的分离和纯培养选择培养分离方法：第二十六页，共六十二页，2022年，8月28日选择培养基直接分离一、微生物的分离和纯培养选择培养分离方法：如：耐高温菌采用高温筛选；蛋白酶产生菌加牛奶筛选；抗抗生素可采用加抗生素筛选待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制第二十七页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养选择培养分离方法：富集培养特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加从自然界中分离到所需的特定微生物第二十八页，共六十二页，2022年，8月28日根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类分离培养在特定环境中能生长的微生物富集培养第二十九页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养二元培养物：培养物只含两种微生物，并有意识保持两者之间的特定关系的培养物为二元培养物。如：病毒－－宿主，原生动物－－细小微生物第三十页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养微生物菌种保藏技术：为何保藏如何保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。要求：菌种不死，不污染，不变中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM)，中国典型培养物保藏中心（CCTCC），美国典型菌种保藏中心（ATCC）等第三十一页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养微生物菌种保藏技术：如何保藏根据菌种特性和保藏目的不同，给特定环境使其存活而得以保存连续移种或改变环境条件：干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等第三十二页，共六十二页，2022年，8月28日斜面：可保存数周至数年，可用石蜡或橡皮塞封口，低温延长保存时间液体：菌苔制成菌悬液，低温（悬液保藏法）缺点：繁琐、易污染、变异丧生原有特性一、微生物的分离和纯培养微生物菌种保藏技术：传代保藏斜面、半固体琼脂柱、液体第三十三页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养微生物菌种保藏技术：冷冻保藏液氮保藏、低温冰箱等液氮可达－196℃，效果较好注意：速冻，减少冰晶损伤细胞第三十四页，共六十二页，2022年，8月28日一、微生物的分离和纯培养微生物菌种保藏技术：干燥保藏沙土管保藏、冷冻真空干燥保藏沙土管：产孢子菌。制成孢子悬液，加无菌沙土管，减压抽干水分，石蜡封口，冰箱保存。冷冻真空干燥：加保护剂样品预先冷冻，真空冰升华去水，低温保存，保存数十年，目前最普遍、最重要的方法，菌种保藏中心多采用此法。菌种保藏时采用不同手段保藏，防止某种方法失败导致菌种丧失。第三十五页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术决定显微观察效果重要因素：分辨率和反差分辨率：辨别两点之间最小距离的能力反差：样品与背景区别程度普通显微镜机械装置：镜座、支架、载物台、调焦螺旋光学系统：物镜、目镜、聚光器

普通显微镜结构示意图显微镜种类和原理：第三十六页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？目镜：10~15╳；物镜：100╳；总放大倍数1000~1500╳；如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？使用油镜，即在100╳物镜和载玻片之间滴加香柏油；香柏油与玻璃折射率相近第三十七页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术

0.5l分辨率（最小可分辨距离）=————nsinq分辨率与所用波长成反比！第三十八页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术分辨率与所用波长成反比！第三十九页，共六十二页，2022年，8月28日N：玻片与物镜间介质的折射率空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质二、显微镜和显微技术第四十页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术光线在穿过折射率不同的介质时发生折射第四十一页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术浸没油与玻璃的折射率相近很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。第四十二页，共六十二页，2022年，8月28日暗视野显微镜二、显微镜和显微技术活细菌在普通显微镜下是透明，观察不清，采用暗视野显微镜，如：黑夜看星星就很清楚。

暗视野显微镜结构与照明示意图第四十三页，共六十二页，2022年，8月28日暗视野显微镜二、显微镜和显微技术特殊聚光器实现斜射照明，给样品照明的光线不直接穿过物镜，而经样品反射或折射后进入物镜，使样品与背景差别大，可以清楚看到透明微小颗粒。用于：生活细菌运动性观察。第四十四页，共六十二页，2022年，8月28日相差显微镜二、显微镜和显微技术第四十五页，共六十二页，2022年，8月28日相差显微镜二、显微镜和显微技术光线透过透明标本，波长（颜色）和振幅（亮度）没有多大变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态和内部结构难以分辨。细胞各部分折射率和厚度不同，当光线通过时，直射光和衍射光光程有差别，而人眼看不到，但是可通过相差显微镜看到。相差显微镜采用特殊光学装置：环状光阑和相差板，利用光的干涉，将光的相位差转变为人眼可见的振幅差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞内的某些显微结构。其发明人F.Zernike因此获1953年诺贝尔物理奖。第四十六页，共六十二页，2022年，8月28日荧光显微镜二、显微镜和显微技术荧光素吸收uv放出波长较长的可见光，因此在uv照射下，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体，为荧光显微技术原理。在免疫学和分子生物学应用广泛。第四十七页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术荧光显微镜第四十八页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术透射电子显微镜（简写TEM）用波长短的电磁波取代可见光，使分辨率提高。工作原理类似，因光源不同，有区别:电子若遇空气中分子会发生偏转使物象不清楚，因此镜筒高真空2)电子带电荷，电镜是用电磁圈使之聚焦3)电子像人眼看不到，用荧光屏显示或感光胶片记录第四十九页，共六十二页，2022年，8月28日大肠杆菌透射电子显微镜图第五十页，共六十二页，2022年，8月28日扫描电子显微镜（SEM）扫描电子显微镜大肠杆菌扫描电镜图二、显微镜和显微技术工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。主要用于：样品表面结构第五十一页，共六十二页，2022年，8月28日扫描隧道显微镜（STM）二、显微镜和显微技术80年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。其横向分辨率：0.1～0.2nm，纵向分辨率：0.001nm这种分辨率足以对单个原子观察。利用这种显微镜直接观察蛋白质、DNA、RNA等以及CM、virus等结构。第五十二页，共六十二页，2022年，8月28日厨房抹布上的细菌和霉菌棉纤维上的汗垢扫描隧道显微镜下的DNA第五十三页，共六十二页，2022年，8月28日显微样品制备二、显微镜和显微技术样品好坏直接影响观察结果。考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制样方法，尽可能使样品生理结构稳定，采用各种方法提高反差。第五十四页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术显微样品制备之光学显微镜制样光学显微镜制样活体观察染色压滴法悬滴法菌丝埋片法活菌死菌美蓝染色简单染色鉴别染色革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色第五十五页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察压滴法：菌悬液滴载玻片，加盖玻片直接观察悬滴法：盖玻片滴一滴菌悬液，反转置于特制凹载玻片直接观察菌丝埋片法：无菌小玻璃纸铺平板表面，涂布孢子悬液，培养后，取下玻璃纸置于载玻片，观察光学显微镜样品制备－－活体观察第五十六页，共六十二页，2022年，8月28日活体观察难看到微生物的细致形态和结构，需染色观察。染色前需要对样品固定，目的：杀死细菌使菌体黏附在玻片上；还可增加对染料的亲和力。常用：酒精火焰加热和化学固定两种方法二、显微镜和显微技术光学显微样品制备－－染色观察第五十七页，共六十二页，2022年，8月28日二、显微镜和显微技术大肠杆菌革兰氏染色

枯草杆菌革兰