结核病实验室诊断现状

结核病实验室诊断现状主要内容一、患者发现二、结核病控制对实验室的要求三、结核病实验室诊断现状四、结核病实验室存在的问题五、结核实验室诊断的主要难题六、十二五结核病实验室建设结核病难上加难！筛查/诊断/确诊难PPD医学检验X线临床症状传染/传播性强呼吸道飞沫传播1人-10-15人并发症/合并症糖尿病艾滋病

发现难症状隐匿/多样早期症状轻微-易漏诊咳嗽、咳痰、低热起病缓慢-病程长全程难治疗难耐多药肺结核结核病流调-疫情显示

结核病疫情特征人群筛查缺少可靠的实验室筛查技术菌阴占多数菌阴肺结核患者多临床诊断临床诊断难度加大无症状无症状患者比例明显增加结核病难上加难！一、患者发现2012年全国结防机构登记活动性肺结核患者894199例，登记率66.37/10万，涂阳患者358149例（占40.05%，登记率为26.58/10万），涂阴患者508620例（占56.88%）未查痰2073例（占0.23%），结核性胸膜炎25357例（占2.84%），与2011年相比涂阳减少65681例，涂阴增加53960例2012年登记的耐多药肺结核患者共2731例患者发现2012年全省结防机构登记活动性肺结核患者47334例，登记率82.70/10万，涂阳患者21339例（占45.08%，登记率为37.28/10万），涂阴患者25731例（占54.36%），未查痰,12例（占0.03%），结核性胸膜炎252例（占0.53%），与2011年相比涂阳减少4812例，涂阴增加5427例2012年湖北省登记耐多药肺结核患者210例

患者发现据WHO估算，每年新发MDR-TB患者50万，XDR-TB5万，目前检测到的耐多药结核病病例仅占全球负担的5%，广泛耐药结核病（XDR-TB）则更低依据我国第5次结核病流行病学调查结果。我国结核病患者中涂阳患者占14．4％(118／1310)，菌阳(涂阳或培阳)患者占26．5％(347／1310)，菌阴患者占73．5％(963／1310)根据07-08耐药监测结果估算，我国每年新发MDR-TB患者12.1万，XDR-TB1万提示虽然实验室发现了大量患者，但诊断技术与能力仍然缺乏二、结核病控制对实验室的要求结核病正确诊断是发现、治疗和管理结核病患者的基础。实验室诊断起着重要的作用，特别是细菌学诊断WHO1995年把DOTS策略作为全球结核病控制策略，肺结核症状可疑者使用痰涂片检查发现传染性患者是DOTS策略5要素之一2005年提出的遏制结核病策略，仍然将采用细菌学方法发现患者作为要素之一，并提出协作研发新型诊断技术对实验室的要求当前，抗酸菌涂片镜检、结核分枝杆菌分离培养和药物敏感性试验等常规方法仍然是发达国家和发展中国家细菌学诊断的主要方法，它不仅是发现传染源的最主要手段，也是确诊结核病、选择治疗方案、考核疗效以及评价防治效果的可靠指标对实验室的要求目前的常规实验室方法虽各有长短，但总体上仍不能满足结核病诊断的要求。快速、准确、简便和低廉的实验室诊断技术一直是人们不知疲倦追求的目标。特别是，近年来人们将控制潜伏性感染或是临床前期感染作为控制结核病的早期策略之一，这些对实验室工作提出了较高的要求对实验室的要求在发达国家，由于结核病疫情低，具有特征性的持续咳嗽、发热等症状已经不再是疑似结核病的可疑症状，在这些国家需要：能够在高危险人群中确定潜伏性感染的方法能够替代x线光片和痰涂片来发现移民和其他高感染风险人群中活动性结核病的措施能够替代传统培养方法的早期诊断手段能够快速便捷的区别医源性感染和社区获得性感染的指纹分析手段能代替生化方法来进行菌种鉴定的新技术。对实验室的要求在发展中国家，尤其是结核病高负担国家，结核病暴露史已经很难进行确定和评估，一些免疫学方法也在实验室诊断中起着一定的作用，如血清学方法，但是，广泛的卡介苗(BcG)接种和HIV感染影响了一些血清学方法的特异性。对于寻找快速、可信、简便的方法来替代现行的涂片显微镜检查的需求不很迫切，这些国家的需要倾向于：较传统培养方法更敏感、快速、简便的手段来诊断涂阴肺结核和无症状的结核病患者在耐药结核病高流行国家需要快速、可靠、廉价的方法来发现耐药结核病患者在HIV感染者中简便的筛查结核病患者的方法三、结核病实验室诊断现状

1、发达国家的结核病实验室诊断现状涂片常规镜检、分离培养和药物敏感性试验仍然是大多数发达国家临床实验室诊断技术的主流与此同时一些快速诊断技术如基于液体培养的方法、核酸杂交、16s核糖体基因的测序、应用HPLc对细胞壁脂质(分枝菌酸)的分析、核酸扩增检测（NAAT)，以及荧光原位杂交和噬菌体生物扩增技术等方法也成为他们的常规方法免疫学检测方法也取得不错的结果，特别是γ干扰素释放试验在发达国家得到了较广泛的应用测序技术在药敏检测中得到应用1、发达国家的结核病实验室诊断现状基因分型技术在发达国家被广泛使用，主要方法有：限制性酶切片段长度多态性(IS6110一RFLP)、数目可变的串联重复序列(VNTR)、分枝杆菌散在重复单位分型(MIRU)、间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)，单核苷酸多态性分析(SNPS)、长片段多态性(LSP)以及缺失图谱等方法在一定条件下可以追溯和确定传染源，鉴别未知传播，发现和鉴别培养的假阳性2、发展中国家结核病实验室诊断现状从全球来看，结核病的高负担国家主要集中在发展中国家，由于经济发展程度所限，已经被使用了百余年的痰涂片显微镜检查技术和分离培养技术仍然是发展中国家结核病实验室诊断体系中所采用的主要方法尽管痰涂片显微镜检查在HIV高流行地区其灵敏度不是很高，但是其简便、价廉并能够检测出传播意义更为重要的排菌患者wHO在发展中国家仍然推荐使用涂片镜检作为结核病控制规划中患者发现的基本手段，在这些国家，只是在少数地区的实验室能开展分离培养和药物敏感性试验等3、我国结核病实验室诊断现状我国结核病实验室诊断体系已经建立多年，总体上由三部分组成第一，国家、省、地市和县级结核病控制体系中的实验室，对结核病控制工作做出了重要贡献，在体系中地市、县结核病实验室（包括近两年出现的定点医院实验室）当前以涂片镜检为主要技术手段，部分县市开展了培养，部分地市开展了药敏和分子生物学快速诊断技术我国结核病实验室诊断现状第二，结核病专科医院的临床细菌学实验室，开展涂片镜检、分离培养和药物敏感性试验等较为全面的细菌学方法，也能采用快速培养、分子生物学技术及免疫学检测技术对于一些特殊病例进行鉴别诊断第三，综合医院中的结核病实验室（很少有），很少开展或不常开展细菌学检查，多采用一些可靠性不高的免疫学检测进行实验室诊断设备名称全球基金项目中盖结核病项目一期中盖结核病项目二期我省情况LED30个省89个地市908个县区1027台3个省4个地市6个县区14台4个省4个地市25个县区46台全覆盖Hain30个省89个地市125台（NTRL1台）4个省4个地市

4台2个省2个地市

5台（NTRL1台）省本级及4地市共5台Genechip无4个省4个地市

4台1个省1个地市

3台省本级及4地市共6台GeneXpert30个省89个地市865个县区934台2个省3个地市

4个县区尚未采购省级及全球基金项目县共39台新型检测技术应用情况-1设备配备情况设备配备情况其他达米恩项目：为贵州贵阳、青海西宁地市级及所辖县区配备LED荧光显微镜梅里埃项目：为广西柳州、新疆喀什地市级及所辖县区配备LED荧光显微镜省级经费：液体培养自动化检测系统：北京、上海、河南、浙江等LED荧光显微镜：湖北、山东、浙江等基因芯片：湖北新型检测技术应用情况-2中盖项目试点地区新诊断技术组合模式镇江市Hain组合方案：县级采用LED+胸片+临床检查的方案进行诊断，并对涂阴患者做培养；地市级对涂阳的痰标本或涂阴培阳的菌株开展Hain耐药快速检测；经耐药快速检测诊断为利福平耐药的患者进一步开展二线抗结核药物传统药敏试验，检测其广泛耐药性。宜昌市Genechip组合方案：县级采用LED+胸片+临床检查的方案进行诊断，并对涂阴患者做培养；地市级对涂阳的痰标本或涂阴培阳的菌株开展Genechip耐药快速检测；经耐药快速检测诊断为利福平耐药的患者进一步开展二线抗结核药物传统药敏试验，检测其广泛耐药性。汉中市Hain组合方案：县级采用LED+胸片+临床检查的方案进行诊断；地市级对涂阳的痰标本开展Hain耐药快速检测；经耐药快速检测诊断为利福平耐药的患者进一步开展二线抗结核药物传统药敏试验，检测其广泛耐药性。新型检测技术应用情况-3关于Hain和基因芯片的建议适用于地区及以上级实验室仅适用于涂阳标本和结核分枝杆菌阳性培养物的检测操作需要至少有3个独立的实验室以避免交叉污染仅能检测MDR，XDR的检测仍需要依靠传统药敏试验可以独立作为MDR的诊断工具对于MDR病人，仍需要传统的培养（固体或液体培养）检测治疗效果（培养阴转）临床报告必须取得省级临床检验中心颁发的《临床基因扩增实验室》许可证建议的覆盖面:每50－100万人口至少需要1个LPA实验室或基因芯片实验室，就我国目前实际情况100万人口地市的级建立一个相应实验室是可行的XpertMTB/RIF检测结核分枝杆菌检测利福平耐药直接标本检测100分钟可获得结果WHO关于XpertMTB/RIF的建议XpertMTB/RIF应该用于怀疑MDR-TB的病人、以及HIV合并结核的病人的最初诊断（强烈推荐）XpertMTB/RIF在MDR或HIV问题不十分严重的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测，特别是用于涂阴标本的进一步检测（根据具体情况推荐，需考虑当地的资源）说明WHO在“2011年全球结核病控制报告”中对该试剂的评估结论为：单次XpertMTB／RIF检测可检出99％的涂片阳性(简称涂阳)和>80％的涂片阴性(简称涂阴)肺结核病患者。但有文献报道，单次XpertMTB／RIF检测涂阴培阳样本的检出率分别为72．5％和76．9％。由于涂阴患者包括涂阴培阳、涂阴和培养阴性(简称培阴)两种类型，而涂阴培阴患者的检出率必然低于涂阴培阳患者，因此，该报告中XpeftMTB／RIF的MTB涂片阴性患者阳性检出率较实际值偏高说明涂阴特别是涂阴培阴患者的诊断有进一步探讨的必要，根据该检测试剂公开发表的数据，该试剂的敏感度研究均以培养或涂片阳性作为判断标准。涂阳培阳样本检出率为99．8％，培阳样本的检出率也高达90％，具有高敏感度。根据我国第5次结核病流行病学调查结果，以我国痰菌阳性(简称菌阳)患者占患者总数26．4％进行推算，该试剂的理论检出率仅为23．7％；我国结核病涂阴培阴患者占患者总数的73．6％说明

XpertMTB/RIF适用于痰标本（包括去污染后的痰标本），肺外标本应用XpertMTB/RIF的研究十分有限。增加检测次数可能会增加XpertMTB/RIF的敏感性，但是需要考虑资源情况上述建议也适用于儿童不能取代传统的涂片检查、培养和药敏试验（治疗监测、流行病学调查、其他一线药物以及二线药物的药敏试验）在MDR低风险组（如新病人）XpertMTB/RIF检测结果为利福平耐药者，建议用传统药敏试验或LPA进行确认新检测技术验证评估与应用完成评估国产环介导核酸等温扩增试剂盒新型检测检术应用情况-4其他正在开发或评估的新技术方法商品检测目的流体芯片法MDR-TB检测荧光定量PCR溶解曲线法检测MDR-TB/XDR-TBMODS（显微镜观察药敏实验）无商品化试剂盒检测分枝杆菌的药物敏感性噬菌体生物扩增法诊断结核感染及药物敏感性新的固体药敏方法硝酸盐还原试验（无商品化试剂盒）诊断菌株对异烟肼和利福平的敏感性薄层琼脂培养法（无商品化试剂盒）诊断结核感染以及对异烟肼和利福平的敏感性颜色指示方法刃天青法（无商品化试剂盒）检测菌株对利福平和异烟肼的敏感性分子水平线性探针杂交（LiPA）基因芯片法（Genechip）多重连接再扩增（MLPA）变性高效液相色谱（DHPLC）质谱（MALDI-TOFMS）焦磷酸测序（Pyrosequencing）实时PCR（Real-timePCR）

线性探针（V2)

多色巢式荧光定量(GenXpert)分子诊断技术免疫学诊断结核菌素试验：用于流调、卡介苗接种、筛查、临床诊断与鉴别诊断，但PPD有多种分枝杆菌的蛋白成分，因而特异性差，且结果观察不便结核抗体测定：结核抗原测定：能早期检测，技术简便快捷，但难以获得高特异性的抗体，目前尚缺乏结核抗原检测试剂细胞因子检测：免疫学诊断结核抗体测定:结核分枝杆菌感染机体，患者或有特异性IgG、IgM、IgA形成，联合检测可提高灵敏性优点：简便快速，有一定的敏感性和特异性，对结核病的诊断与鉴别诊断有参考价值缺点：假阳性较高，没有单一抗原被所有患者识别

总的来说，结核病患者的抗体反应是不完全相同的，要求设计一个由多种抗原组成的鸡尾酒式的结核病血清学诊断试验。具有灵敏度高和特异性强的结核病血清学诊断试剂要求由多种抗原的混合体构成

因此以后的研究方向是筛选各种特异性强、灵敏度高的抗原组成混合抗原，研制结核病血清学诊断试剂。有很多研究者已经进行或正在进行这方面的研究，相信在不久的将来这种研究成果可以应用于临床，服务于结核患者免疫学诊断1个决定性因素-抗原特异性/灵敏度潜伏/感染初期活动性肺结核脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗原敏感性63%；特异性92.4%作为属特异性抗原的脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成，拥有较强免疫原性与免疫调价的功能，能刺激机体促进相应抗体产生，故可作为为结核病血清学诊断抗原，应用较广泛。对活动性肺结核患者的检测敏感性为63.0%特异性达92.4%，提示LAM抗体检测不失为一项结核病辅助诊断的有效方法U1蛋白-早期/特异性U1蛋白（UrineProtein1)为Mukherjee等收集结核分枝杆菌H37Rv株静脉感染C57BL/6小鼠早期（10-14天）尿液中分离得到的结核抗原，经氨基酸测序鉴定后，克隆表达获得可溶性重组蛋白，分子量约为16.8KDa。以ELISA法检测肺结核患者血清中U1抗体，显示其敏感性为60%对合并HIV感染的结核病患者进行检测的敏感性为87%，正常人血清则不与U1蛋白产生反应。38KDa与16KDa敏感性提高11.1%联合检测可提高11.1%的敏感性。结核分枝杆菌抗原多而复杂，在宿主体内表达的数量、种类或时机可能随病人的个体免疫背景和病程而异，表现出不同的抗原抗体谱。检测时有的抗原不表达，未检测出相应的抗体；有的抗体含量高，有的则低。产品核心优势关于4种抗原的学术研究进展是a-晶状小分子热休克蛋白家族的成员。该蛋白携带有结核杆菌特异性的B细胞表位，用单克隆抗体检测发现其至少存在四种不同的抗原决定簇，能诱导特异的体液免疫应答。14KDa蛋白在感染初期就具有明显的免疫原性14KDa蛋白-感染初期免疫学诊断细胞因子检测细胞因子:是由细胞分泌，影响细胞生物学行为、调节免疫功能和对炎症反应的一类物质，被广泛研究的有TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、白细胞介素和干扰素等肿瘤坏死因子-α参与了结核病的发病过程，与结核病产生的炎症反应程度有关，为重要的前炎症因子和免疫调节因子。国内研究表明，结核病活动期患者血清TNF-α水平较健康对照组明显升高免疫学诊断γ-干扰素释放试验：目前研究认为：一、特异性高，不受卡介苗和非结核分枝杆菌的干扰，同时也不受能导致类结核症状的其他病原的影响二、敏感性好，特别是对菌阴肺结核和肺外结核有90%以上的检出率三、非人体试验，不随访，结果判断客观四、检测到γ-干扰素浓度的高低认为与体内感染结核杆菌的载量多少相关五、无法区分是否活动性结核，在高流行地区，检测阴性结果排除结核的意义更大六、价格高，广泛应用有一定的难度四实验室存在的问题1、结核病防治体系的变革，为结核病实验室网络建设提出了新课题疾控中心结核病实验室能力出现弱化现象：职能定位不清，责、权、利不明，人员减少，设施、设备缺乏，无日常工作，熟练度不能保证，新技术推广无经费及基础定点医疗机构结核病实验室工作处于初始阶段，医院对实验室定位不清，资质不完备，实验条件不够，人员不够、能力欠缺，相关检测项目收费局限，开展检测项目意愿不高，质量意识薄弱存在的问题2、实验室生物安全问题：根据我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《实验室生物安全通用要求》的规定，卫生部印发的《人间传染的病原微生物名录》的要求，对于结核分枝杆菌大量活菌操作须在符合生物安全三级(BsL_3)的环境中进行，而对于样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学实验、PcR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动，可以在符合生物安全二级(BsL_2)的环境中进行，许多实验室不能达到生物安全的要求存在的问题3、合格实验标本的采集4、实验室人员结构和能力建设5、适应现在需要的结核病实验室检验规程、规范的编印出版及推广应用不够，造成实验结果的可靠性和互认程度不高

6、新技术的评估、选择和应用新技术评估，对照标准选择的科学性存在偏差新技术应用存在某些限制因素硬件设施的要求、资质的要求、人员能力费用较高与传统技术相结合

7、整体应急能力较弱缺乏快速、准确的储备技术存在的问题

8、质量保证体系的建立和完善传统方法质量保证体系还有待进一步完善和在疾控及医疗系统的推广及应用的分子生物学等新技术、新方法的质量保证体系尚待建立新技术设备/试剂，评估，推广应用后迫切需要有效的质量保证体系9、整体科研能力有待于提升基础性研究实施性研究存在的问题五结核实验室诊断的主要难题1涂阴肺结核实验室诊断、潜伏感染(LatentTBinfection，LTBI)的诊断、没有简便、准确、可靠、单一的方法2、结核合并HIV感染患者诊断困难，结核病是ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者最常见的感染性疾病，也是ＨＩＶ／ＡＩＤＳ最常见的死亡原因。ＨＩＶ可促使结核病发病，ＴＢ感染后易迅速发展，播散，死亡率极高，同时由于患者免疫功能缺陷，实验室诊断效率较低3、MDR—TB和XDR—TB的产生与流行，凸显出对结核病进行快速、有效诊断和治疗的重要性主要难题4、小儿结核与老年结核病诊断困难小儿结核的一个最大特点是带菌量少，细菌学检测方法不易检出，３０％～４０％的小儿结核患者细菌学检查呈阴性，若合并感染ＨＩＶ，则诊断更难；老年结核诊断难的主要原因是临床表现不典型，常合并其他严重疾病而掩盖了结核病情，同时免疫功能低下也使实验室诊断方法（如ＴＳＴ）应用于老年结核诊断时，检测灵敏度一般都较低主要难题5肺外结核诊断困难肺外结核病发生在肺部以外各部位，如不及时诊断治疗会造成脏器功能受损，甚至危及生命。其诊断困难的原因有：①患者的病情往往被其他病症所掩盖，就诊时极易误诊，如脑结核易误诊为脑膜炎等；②病灶取材不方便，难以获得细菌学证据；③相当大一部分肺外结核患者免疫功能低下或缺陷，很多实验室诊断方法使用时灵敏度较低6突破性的结核病实验室诊断新技术六、十二五结核病实验室建设与发展规划目的

建立健全全国结核病实验室网络服务体系，提高各级结核病实验室服务质量和水平,提高结核病的早期、快速诊断能力十二五结核病实验室总体目标1、100%的省级参比实验室具备分子生物学诊断和快速菌种鉴定能力2、100％的地（市）级实验室具备药物敏感性试验能力3、80％的区（县）级实验室具备分枝杆菌培养能力4、县级以上医疗机构的结核病实验室纳入网络服务体系，建立全国结核病实验室网络信息服务平台