第六部分体外转录和翻译

第六部分体外转录和翻译第一页，共五十五页，2022年，8月28日Invitrotranscription第二页，共五十五页，2022年，8月28日InVitroTranscription目的:体外得到单一,大量的mRNA意义:探针原位杂交siRNARNAiTranscript体外翻译,蛋白表达第三页，共五十五页，2022年，8月28日InvitroTranscriptionT7T3EcoRIBamHIAntisense:CutwithEcoRIUseT-3polymeraseSense:CutwithBamHIUseT-7polymerase第四页，共五十五页，2022年，8月28日第五页，共五十五页，2022年，8月28日第六页，共五十五页，2022年，8月28日VectorMaps第七页，共五十五页，2022年，8月28日InvitroTranscriptionPlasmidwithT3,T7orSP6promotersLinearizationofplasmidDNAbyrestrictionenzymeInvitrotranscription:Plasmid

buffer

NTP

labeledUTPRNApolymeraseDNAsedigestion,Phenol/ChloroformextractionandRNAprecipitataion第八页，共五十五页，2022年，8月28日GlovesshouldbewornatalltimesduringpreparationofinvitroRNA.AllsolutionsshouldbeRNase-freei.e.madewithDEPCwaterifhome-madeorboughtspecificallytouseforRNAwork.Invitrotranscriptionreaction第九页，共五十五页，2022年，8月28日Youwillneed:

-Ribonucleaseinhibitor(RNasin)

-T7orT3RNAPolymerase-2.5mMrNTPs

-5xT7/T3RNAPolymeraseBuffer(200mMTris.ClpH8.0,125mMNaCl,40mMMgCl2,10mMspermidine)-100mMDTT

-RNase-freeDNaseI-DEPC-treated,autoclavedInvitrotranscriptionreaction第十页，共五十五页，2022年，8月28日Linearizetheplasmidat,ornear,theterminusoftheinsertcDNAwithasuitablerestrictionendonuclease.ExtractplasmidDNAwithanequalvolumeofphenol/chloroformandanequalvolumeofchloroformpriortoethanolprecipitation.LinearizedplasmidDNAisresuspendedinDEPC-treated,autoclavedTE,pH7.5ataconcentrationofapproximately200ng/ulpriortouse.Invitrotranscriptionreaction第十一页，共五十五页，2022年，8月28日4)Thestandardreactionconditionsaresetupcontainingthefollowingquantities:-2ul(400ng)linearizedplasmidDNA

-20Uribonucleaseinhibitor

-2ul100mMDTT

-4ul5xT3/T7RNApolymerasebuffer

-4ul2.5mMNTPs

-Sterile,DEPCtreatedH2Otoafinalvolumeof19.5ul

25U(0.5ul)T3/T7RNApolymeraseThereactionmixtureisincubatedat37°Cfor60minutes.第十二页，共五十五页，2022年，8月28日DNAtemplateisremovedbytheadditionof25URNase-freeDNaseIandafurtherincubationfor30minutesat37°C.Thereactionmixtureisphenol/chloroformextractedtwice,ethanolprecipitated,vacuumdriedandresuspendedin25ulsterile,DEPC-treatedTE,pH7.5.RNAcanbeanalysedbeelectrophoresisusingdenaturingconditionsinanagarose/formaldehydegelsystem.第十三页，共五十五页，2022年，8月28日InVitroTranscription探针原位杂交siRNARNAiTranscript体外翻译,蛋白表达第十四页，共五十五页，2022年，8月28日AdvantagesofRNAprobes:RNA-RNAhybridsareverystableTissuecanbedigestedwithRNase(dsRNAisnotdigested)afterthehybridizationreducingthebackgroundHigherspecificactivitycomparedtooligonucleotides第十五页，共五十五页，2022年，8月28日InVitroTranscribedsiRNAsInVitroTranscribedsiRNAs

-EquallyeffectiveaschemicallysynthesizedsiRNAs-DesigneffectivesiRNAAdvantages-Price-Shorterturn-aroundtimeDisadvantages-Morehands-on-Scalability第十六页，共五十五页，2022年，8月28日第十七页，共五十五页，2022年，8月28日第十八页，共五十五页，2022年，8月28日Invitrotranslation第十九页，共五十五页，2022年，8月28日测序技术,PCR,RT-PCR技术,芯片技术,RNA干扰技术核酸信息蛋白质功能第二十页，共五十五页，2022年，8月28日DNA水平缺失基因,上调下调基因的表达水平对生命过程的影响分离纯化蛋白质,研究其基本特性,直接在蛋白质水平进行研究蛋白质功能研究思路第二十一页，共五十五页，2022年，8月28日蛋白样品的获得收集大量的生物材料纯化(材料来源受限)重组表达的方式(费时费力)体外表达(Invitrotranslation,快速,高通量快速筛选)第二十二页，共五十五页，2022年，8月28日Invitrotranslation利用体外表达，除了利用载体克隆，更快速的选择是——在PCR时两端加上不同的启动子序列就可以得到体外表达的模板材料了。不利用细胞表达,体外表达不需要花时间转化转染细胞、也不需要筛选重组克隆，也不需要培养细胞，加入特定的细胞裂解物，利用其中的核糖体、合成酶、tRNA、翻译起始、延伸、终止因子、氨基酸等等蛋白质合成的必需元件，在适合的温度下只需几个小时就可以得到蛋白质产物，大大节约了时间和精力，在快速鉴别基因产物上就格外有优势。第二十三页，共五十五页，2022年，8月28日体外表达可以避免过量表达对细胞的毒性，或者形成不溶的包含体，以及表达产物在细胞内的降解，因而可以表达一些对细胞具有毒性的或者不稳定、容易被降解的蛋白。减少了蛋白变性复性的困扰。体外表达还可以在体系内添加特殊的修饰氨基酸或者标记氨基酸，非常灵活，因而在蛋白质折叠和蛋白质功能研究上都有重要应用。第二十四页，共五十五页，2022年，8月28日Cell-FreeExpressionSystems:1:E.colilysate

tolerance2:Rabbitreticulocyte:betterforlargeproteins

3:Wheatgermextract:betterforsmallerproteinscheaperthanrabbitreticulocyte第二十五页，共五十五页，2022年，8月28日真核体外表达体系并非只适用于真核基因，原核也并非只限于原核表达——在灵活的体外表达系统中，只要序列满足启动子和核糖体结合位点的需求，任何系统均可匹配任何基因。第二十六页，共五十五页，2022年，8月28日Allarepreparedascrudeextractscontainingallthemacromolecularcomponents:-70Sor80Sribosomes-tRNAs,aminoacyl-tRNAsynthetases-initiation,elongationandterminationfactors,etc.Toensureefficienttranslation,eachextractmustbesupplementedwith:-aminoacids-energysources(ATP,GTP)-energyregeneratingsystems(creatinephosphateandcreatinephosphokinaseforeukaryoticsystems,andphosphoenolpyruvateandpyruvatekinasefortheE.colilysate)-otherco-factors(Mg2+,K+,etc.).第二十七页，共五十五页，2022年，8月28日真核VS

原核满足启动子和核糖体结合位点第二十八页，共五十五页，2022年，8月28日E.colilysate对大肠杆菌蛋白合成机制十分了解,成本低,不需加帽简单高效,可偶连体外转录和翻译,不需分步优化条件耐受性(在含有其它不同成分杂质时仍可正常工作)-加入特殊添加剂(蛋白酶抑制剂,分子伴侣etc)-特殊的修饰氨基酸或者标记氨基酸获得带标记蛋白

弹性大,加入优化成份一提高产率和溶解性(例如：修饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正确的二硫键，然后正确的折叠。)

第二十九页，共五十五页，2022年，8月28日E.coliT7S30S30原核体外翻译系统的E.coliT7S30提取物是由OmpT内切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coliB菌株制备,因此可增加稳定性,尤其适用于在体外表达时易被蛋白酶降解的蛋白质.也适合那些在体内表达由于宿主编码的抑制酶作用而表达水平低的蛋白质,使其能高表达.还可用于转录和翻译调控的研究可合成少量标记蛋白质用于蛋白纯化中作为示踪物质以及在蛋白质中掺入非天然的氨基酸用于研究蛋白质的结构功能第三十页，共五十五页，2022年，8月28日S30体外翻译系统(Promega)灵活,能使用含有T7启动子和一个核糖体结合位点的任何克隆进行翻译稳定,减少所表达蛋白质被降解的机会简便,包含和所有偶联的转录/翻译所需要的组份低背景,系统合成的内源蛋白质水平低缺少一种氨基酸的氨基酸混合物以备标记需要使用方便混合好需要的各组分和模板,37度保温1-2小时后置冰上5分钟PAGE电泳,western检测,或TCA沉淀纯化第三十一页，共五十五页，2022年，8月28日S30的应用合成放射性同位素标记的蛋白质在E.coli体内表达蛋白质之前核实克隆的基因用蛋白质进行转录和翻译调控的研究用蛋白质作为蛋白纯化的示踪物在蛋白质中掺入非天然氨基酸作结构研究第三十二页，共五十五页，2022年，8月28日RocheRTSE.Coli偶联反应:连续交换无细胞(CECF)系统反应高产率(HY)生化体系第三十三页，共五十五页，2022年，8月28日RocheRTSE.Coli第三十四页，共五十五页，2022年，8月28日Rabbitreticulocyte(兔网织红细胞系统)兔网织红细胞用活大白兔制备,通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞.兔网织红细胞裂解后,提取物用微球菌核酸酶破坏内源mRNA,最大限度降低翻译背景裂解物包含了蛋白质合成所必需的细胞内组分(tRNA,核糖体,氨基酸,起始,延伸,终止因子)添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统,以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制添加了tRNAs混合物用于扩大mRNA翻译范围第三十五页，共五十五页，2022年，8月28日网织红细胞无细胞核,保留高效翻译各种核酸信息的能力由红细胞分化而来,在体内主要负责合成大量血红蛋白以及球蛋白(90%以上).内源的核酸酶很少,有助于长链RNA的稳定,可以合成较大的蛋白有内源球蛋白mRNA,可通过钙离子依赖的核酸酶除去,并通过EDTA处理使核酸酶失活第三十六页，共五十五页，2022年，8月28日Wheatgermextract(麦胚提取物系统)cheaperthanrabbitreticulocyte麦胚芽提取物经在提取物缓冲液中碾碎麦胚芽，再经离心除去细胞碎片制得。上清夜经过了层析，将抑制翻译的内源氨基酸和植物色素从提取物分开。提取物用微球菌核酸酶处理过，破坏了内源mRNA，以把背景翻译减到最小。麦胚芽提取物包含蛋白合成所必需的细胞组分（tRNA，核糖体，起始、延伸和终止因子）.使用前透析,提取物中添了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统,以及增加链延伸效率的亚精胺,以及一定量的乙酸镁氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制第三十七页，共五十五页，2022年，8月28日由于内源的mRNA很少，这个系统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。当表达产物较难与球蛋白区分（12—15kD）、或者表达产物正好可能是哺乳动物细胞中富含而植物中没有的调控因子一类的蛋白时、或者是不明原因表达不出时，就不妨尝试麦芽提取物体系。可稳定表达一些在兔网织红细胞系统中翻译受到抑制的DNA,如那些含有低浓度的双链mRNA的模板要求RNA有帽子结构才能更好的翻译在合成分子量较大的蛋白质时常提前终止

第三十八页，共五十五页，2022年，8月28日Twoapproachestoinvitroproteinsynthesisbasedonthestartinggeneticmaterial:RNAorDNA.Standardtranslationsystems,suchasreticulocytelysatesandwheatgermextracts,useRNAasatemplate.Becausethetranscriptionandtranslationreactionsareseparate,eachcanbeoptimizedtoensurethatbotharefunctioningattheirfullpotential.Whereas"coupled“systemsstartwithDNAtemplates,whicharetranscribedintoRNAthentranslated.第三十九页，共五十五页，2022年，8月28日SchematicofIn-vitroTranslationRNAgeneratedinvitroutilizesT7,SP6orT3RNApolymeraseinaseparateuncoupledreaction第四十页，共五十五页，2022年，8月28日InVitroTranscriptionandTranslationProcedureUsingRabbitReticulocyteLysate.第四十一页，共五十五页，2022年，8月28日CoupledTranscription:TranslationUnlikeeukaryoticsystemswheretranscriptionandtranslationoccursequentially,inE.coli,transcriptionandtranslationoccursimultaneouslywithinthecell.InvitroE.colitranslationsystemsarethusperformedthesameway,coupled,inthesametubeunderthesamereactionconditions.Duringtranscription,the5'endoftheRNAbecomesavailableforribosomalbindingandundergoestranslationwhileits3'endisstillbeingtranscribed.ThisearlybindingofribosomestotheRNAmaintainstranscriptstabilityandpromotesefficienttranslation.Thisbacterialtranslationsystemgivesefficientexpressionofeitherprokaryoticoreukaryoticgeneproductsinashortamountoftime.Forthehighestproteinyieldandthebestinitiationfidelity,makesuretheDNAtemplatehasaShine-Dalgarnoribosomebindingsiteupstreamoftheinitiatorcodon.CappingofeukaryoticRNAisnotrequired.UseofE.coliextractalsoeliminatescross-reactivityorotherproblemsassociatedwithendogenousproteinsineukaryoticlysates.Also,theE.coliS30extractsystemallowsexpressionfromDNAvectorscontainingnaturalE.colipromotersequences(suchaslacortac).第四十二页，共五十五页，2022年，8月28日CoupledinVitroTranscription:TranslationProcedureUsingE.coliExtract.

第四十三页，共五十五页，2022年，8月28日mRNA设计要求用原核和真核细胞的mRNA转录本有明显的区别。通常真核mRNA带有转录后加工的5‘-7methyl-GTPcap和3’poly(A)tail，有助于增加mRNA的稳定性，防止降解。同时5‘帽子结构有助于核糖体与mRNA的结合和AUG起始密码的正确识别。对应不同的体外表达系统，在设计RNA模版的时候就要区别对待。原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码。这段位于AUG上游的序列和30S核糖体亚基的16srRNA一段序列互补，保守区5‘-UAAGGAGGUGA-3’，核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响。而真核生物的那段保守序列成为Kozak序列（5‘-GCCACCAUGG-3’），要高效翻译，+1G和-3A就很重要。不过如果mRNA没有这段Kozak序列而有一段适当长度5‘UTR也能够有效地在无细胞体系中得到翻译。有数据提示，大肠杆菌的核糖体通常只认得SD序列，而真核比如网织红细胞的核糖体能识别Kozak序列，也能识别SD序列。第四十四页，共五十五页，2022年，8月28日The+1isthefirstbaseoftheAUGinitiatorcodon(shaded)responsibleforbindingoffMet-tRNAfMet.Theunderlineindicatestheribosomalbindingsitesequence,whichisrequiredforefficienttranslation.第四十五页，共五十五页，2022年，8月28日体外翻译的应用第四十六页，共五十五页，2022年，8月28日第四十七页，共五十五页，2022年，8月28日第四十八页，共五十五页，2022年，8月28日第四十九页，共五十五页，2022年，8月28日mRNA定量分析NorthernBlotRT-PCR实时荧光定量PCR（real-timequantitativePC