分子生物学实验

实验一感受态细胞制（4时）一、实验目的：通过本实验，把握大肠杆菌感受态细胞制备的方式和技术。二、实验原理：细菌处于容易吸收外源的状态称感受态。其原理是细菌处于0℃、CaCl低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。2三、仪器、材料和试剂（一）仪器：1.超净工作台2.心机3.温摇床4.压灭菌锅移液枪6.荡器7.天平8.恒温水浴9.离心管10.锥形瓶（二）材料：大肠杆菌α（三）试剂：1.lCaCl液2.LB液体培育基%酒精2四、实验步骤1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于3mlLB液体培育基的试管中，37℃震荡培育留宿。2.取1ml菌夜转接到一个含有LB液体培育基的锥形瓶中，37℃震荡培育2-3h（现在，A应在之间，细胞数务必﹤108/ml，此为实验成功的关键6003.用移液枪取2ml菌液转移到离心管中上放置10min的枪色枪头，旋转不要太快，不能超过量程，每组至少做6管）4.离心（4000r/min和不平稳，利用之前用太平平稳，对称放。上离心机之前，用卫生纸擦离心管。不要贴标签。用记号笔标记就能够够。盖紧离心管口。盖好离心机内盖）5.倒出培育液，将管倒置，以使培育液流尽工作台中操作）6.用冰凉的lCaCl200µl悬浮沉淀（用振荡器在冰上保温。2（200µl的枪，黄色枪头）7.低温离心10min（4000r/min胞。8.用冰凉的lCaCl200µl悬浮细胞（用振荡器29.分装细胞，毎一份，此细胞为感受态细胞。五、实验结果：有白色细胞细胞沉淀显现，该白色沉淀即为大肠杆菌感受态细胞。六、分讨论：

1.么缘故实步骤中A应在之间细胞务必﹤10600

8

/ml？2.骤8都加入CaCl目的一样吗？们的作别离是什么23.实验的注事项有些？实验二阳性隆的挑选与定、质粒DNA提取

（5时）一、验目：过本实验学习和把

。二、实原理一、蓝白斑挑选原理二、碱裂解法提取质粒是依照共价闭合环状质粒与线性染色体DNA之间在拓扑学上的不同而达到分离目的。三、仪、材料、试(一)仪器：一、恒温摇床二、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：一、含PUC-18质粒的大肠杆菌

二、乙二胺四乙酸(EDTA)3甲基氨基甲烷(Tris)4.葡萄糖5.氢氧化钠(NaOH)6.十二烷基硫酸钠SDS)7乙酸(

八、冰醋HAc)

九、盐HCl)10、Tris饱和酚1一仿1二戊醇13醇14RNA1五、羧苄青霉素1六、离心管(三)试剂：一、溶液

二、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液五LEDTA

六、氯:异戊醇(V:V=24:1)7和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)

八、70%乙醇

九、胰RNA酶四、实步骤一、先在3mLLB液体培育基中加入羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，震荡培育留宿。二留宿培育的菌液入离心管中出培育液，将所有菌体

细胞搜集在离心管中少做管）3、加入100

溶液

于含菌体细胞的离心管中涡震荡将细菌沉淀悬浮温放置10min。4、加入200溶液Ⅱ(新鲜配)轻混匀内容物液慢慢变清亮后加入溶液Ш(万万不可用旋涡震荡器，裂解时刻不超过。5、加入

溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。冰上放置15min让质粒DNA复性(万万不可用旋涡震荡器)。6、12000r/min离心，将上清转至另一个离心管中枪取，记着取多少）7、向上清中加入等体积饱和酚：氯仿：异戊醇溶液，旋涡混匀，离心5min，将上清转至另一离心管中。8、向上清中加入等体积氯仿：异戊醇，旋涡混匀，离心5min，将上清转移到另一个离心管中。9、向上清中加入2倍体积无水乙醇，旋涡混匀后，室温放0min离心10min，吸去上清液。10、用200µl70%乙醇洗涤质粒沉淀1次(12000r/min离心5min)倒去上清液，空气中干燥。1一、加入20uLRTE，使质粒DNA完全溶解。五、实结果有白色质粒沉淀，然后又溶解。六、分讨论1溶、溶液Ⅱ、液Ш的作用别离是什2什缘故真生物基因组DNA能用碱裂法提取3本验需要握哪些知识技术？实三目基的5’-结尾PCR扩增、3’-尾PCR增一目的和把握用方式扩增cDNA的5’-结尾和3’-结尾的方式和技术。二、实验原理：

一、聚合酶链反映的原理：类似于的天然复制进程。包括高温变性（

o

C低温退火（50o-60oC伸（72oC）三个时期。二、电泳技术原理：分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。分子量（片段）越小，其在电泳中跑的越快；构型越稳固，跑的越快。三、仪器、材料、试剂：热循环仪2.琼脂糖凝胶电泳系统3.紫外透射仪管、移液枪模板混合物7.引物对(正向引物和反向引物)

酶9.琼脂糖10.11.10×PCRbuffer12.loadingbuffer四、实验步骤：1.依照模板，设计引物。2.在PCR管内配制100µl反映体系。双蒸水70μl10×PCRbuffer10μlmmol/LdNTP混合物8μl正向引物4μl反向引物4μl模板DNA2μlTaq聚合酶2μl3.依照条件，设计程序，进行扩增94oC

预变性2min94

o

C

变性30s55

o

C

退火30s72

o

C

延伸1min重复步骤(2)、(3)、(4)30次72oC总延伸4.琼脂糖凝胶电泳分析结果①将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，并架好样品梳子。②制胶：配制适宜浓度的琼脂糖凝胶。准确称量琼脂糖干粉，放入洗好的锥形瓶内，加15ml倍的（用量筒量取用纸盖着锥形瓶的口，放入微

波炉内加热熔化，然后冷却片刻，加入染色剂，混匀，然后倒入架好的有机玻璃内槽内中，待其凝固30s，然后摇匀，再熔化。倒的时候若是有气泡，用枪头处置）③拔梳子：室温下20-30min，有机玻璃内槽的凝胶形成一层均匀的胶面，警惕拔出梳子。④将有机玻璃内槽连同凝胶掏出泳槽内槽内加入电泳缓冲的TBE没过胶面为宜（约42ml，量筒取⑤加样：别离取2020Loading-buffer匀，用移液枪将混匀的样品缓缓加入点样孔中样个孔）⑥接通电源，红色为正极，黑色为负极，样品由负极向正极移动，一样选择80V电压，电泳时刻为min。⑦当溴酚蓝移动到距凝胶前沿cm处，停止电泳。⑧电泳完毕上电源出凝胶染色室紫外透射仪下观看结果上手套，不要把有机玻璃内槽拿到染色室）五、实验结果：基因存在处显示出绿色荧光条带。六、分析讨论：1.PCR技术的原理？2.RACE技术的原理？实四

目产的收纯

（4学）一、实验目的：学习和把握回收纯化的方式和技术。二、实验原理：采纳平稳酚抽提，无水乙醇和醋酸钠沉淀法，回收纯化。三、仪器、材料和试剂（一）仪器：1.离心机2.琼脂糖凝胶电泳系统3.紫外透射仪4.移液枪（二）材料：PCR产物（三）试剂：饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)

2.氯仿:异戊醇(V:V=24:1)醋酸钠（4.无水乙醇%酒精缓冲液四、实验步骤µlPCR产物补水至200µl等体饱和酚:氯仿:异戊醇涡混匀，12000r/min离心，取上清（约120µl2.加等体积氯仿:异戊醇涡混匀心5min上约3.加等体积无水乙醇（冰上预冷）和体积3M醋酸钠（，充分混匀（漩涡混匀或用手摇200次。4.手动短时离心3-5s，冰上沉淀30min。min离心10min，弃上清。6.用200µl70%乙醇洗涤沉淀1次(12000r/min心5min)，弃上清，空气中干燥。7.加入20µlTE，溶解。8.电泳检测。五、实验结果基因存在处显示绿色荧光条带。六、分析讨论1.如何纯化PCR产物或粗提的？实验五PCR产物与体的连接连接产物转化（5时）一、二、三、

实验目的：学习和把握重组和重组子鉴定的方式。实验原理：酶切—连接—转化—蓝白斑挑选。实验仪器、材料和试剂：

1、

恒温摇床二、离心机3、超净工作台4、恒温水浴五、移液枪

六、液体培育基7、LB固体培育基八

九101一态细胞1二分子试剂EcorI13、solutionI（含目的基因和连接酶）四、实验步骤（一）质粒DNA的制备（二）目的基因的取得（I含目的基因和连接酶）（三）质粒DNA酶切1.别离取两管酶切反映体系：

质粒+5ulEcorI酶+5

酶切反映液+5

无菌水。2.短时离心混匀（10S之内3.37℃保温1h。（四）载体和目的基因的连接1.取两管10

反映体系5

酶切产物+5

SolutionI混匀，16℃水浴1h。（五）连接产物的转化1.取感受态细胞200，加入10连接产物，冰30min。2.热激：42℃保温90s。3.冰浴2min。4.加入800

LB体培育基，37℃慢摇苏醒30min同时在超净工作台上制作选择平板。（六）重组子的鉴定（蓝白斑挑选）1.将苏醒菌液4000r/min离心1min，先吸去800

上清液，再将细胞吹散成细胞悬液，取

细胞悬液直接涂布在含有羧苄青霉素X-gal、IPTG的选择平板上。2.将平板（培育皿）正向放置至液体被吸收，倒置平皿37℃培育，显现菌落，其中白色菌落为重组质粒。五、实验结果：显现的白色菌落为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。

22六、分析讨论：1.蓝白斑挑选的原理？实验六

克隆片段的定（学时）一、实验目的：学习和把握重组克隆的鉴定方式。二、实验原理：克隆位点双侧别离有I和indIII酶切位点，因此这两种酶能够将插入片段从克隆载体中切割下来。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，能够观看插入片段的大小。三、仪器、材料、试剂1.实验仪器离心机、移液枪；制冰机；电泳仪；紫外透射仪。2.材料质粒载体。3.试剂限制性内切酶RI和indIII。四、实验步骤1.挑取生长较好的单菌落入装有2mlLB液体培育基的离心管中，在恒温摇床培育1h，200转）2.提取质粒。3.用RI和indIII内切酶双酶切插入有外源片段的质粒载体，按以下体系配置反映液：

Eco

indIII

4.混匀后，手动离心，置37℃反映1h，反映终止后，电泳检测。五、实验结果：基因存在处显示两条绿色荧光条带。六、分析讨论1.进行双酶切反映注意哪些问题？实验七-酵母表达载体的构建（11个学时）CTAB法提取植物基因组DNA一、实目的：通过本实验学习从植物基因组中提取的方式和实验技术。二、实原理CTAB在高离子强度的溶液中>mol/L与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。制的活性。再用氯仿异戊醇抽提的方式去除蛋白质，取得的DNA溶液经NaAC和异丙醇沉淀。三、仪、材料、试（一）器恒温水浴锅，离心机，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像仪（二）料幼嫩的烟草叶片，，EDTA，NaCl，Tris，2mL离心管，枪头等。（三）剂1、CTAB缓冲液；2、3MNaAc；3、氯仿/异丙醇=24;1；4、70%酒精。四、实步骤

1、CTAB缓冲液置于65℃水浴锅中温浴1h；2、取幼嫩的烟草叶片置于研钵中，加入2mLCTAB缓冲液充分研磨；3、将研磨后的匀浆别离装在离心管中（注意每一个离心管中只装mL的匀浆℃水浴1h，中间倒置混匀4-5次；4、加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1匀5min；3、12000rpm离心min；4、取上层液体，加入μl3MNaAc和800μl异丙醇，倒置混匀后室温静置15min；5、12000rpm离心min；6、弃上清，加入μl70%酒精洗沉淀一次；7、12000rpm离心5min；8、弃上清，沉淀在室温下干燥min后加入30μlddH2O溶解DNA。9、取3-5μl新提取的，琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，其余的样品保留在-20℃冰箱中备用。五、实结果提取取得的DNA应为一条带，若是DNA降解会显现弥散带型。六、分讨论CTAB法提取基因组的原理是什么？实验八-酵母的转化与挑选（4个学时）-基因组DNA的大样酶切一、实目的：通过本实验学习酶切基因组的方式和实验技术。二、实原理在做交之前，基因组酶切是相当重要的一个环节。其中

DNA样品的质量和限制性内切酶的选择将直接阻碍酶切成效I是资料报导中在Southern-blotting最为经常使用的一种酶，酶比较稳固、受抑制剂阻碍较轻，而且比较廉价。三、仪、材料、试（一）器恒温水浴锅，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像仪（二）料基因组DNA（上周提取，枪头等。（三）剂一、I酶；二、Loadingbuffer3、琼脂糖四、实步骤一、酶切体系（总μL程应在冰上操作10×Hbuffer：2μLEcoRI：10-15U（1μL）基因组DNA：5-8μLddHO：9-12μL2Total：20μL二、反映条件：℃反映3h；3、酶切反映的终止：加入2μL10×Loadingbuffer4、凝胶电泳检测：低电压、长时刻跑。五、实结果DNA被切成Smear的带型。六、关知识点一、Takara酶切中常见的及其组成：（1）10×L100mMTris-HCl100mMMgCl

2

10mMDithiothreitol，二硫苏糖醇）（2）10×M100mMTris-Hcl100mMMgCl

210mMDithiothreitol500mMNaCl（3）10×H500mMTris-HCl100mMMgCl

210mMDithiothreitol1000mMNaCl（4）10×K200mMTris-HCl100mMMgCl

210mMDithiothreitol1000mMKCl（5）10×T330mMTris-acetate(pH100mMMg-acetate5mMDithiothreitol660mMK-acetate（6）10×loadingbuffer组成SDS%Glycerol50%BromophenolBlue%

二、Southern-blotting的步骤：基因组DNA的提取—大样酶切—低电压长时刻的电泳（30V，一样留宿）—转膜—杂交—放射自显影。七、分讨论基因组的酶切与质粒的酶切有什么异同点？实验九-报告基因的表达检测（4个学时）-PBS提取植物总蛋白一、实目的：通过本实验学习提取植物总蛋白和利用硫酸铵沉淀法来浓缩蛋白的方式和实验技术。二、实原理在做Nornthern杂交之前，总蛋白的提取和纯化是相当重要的一个环节。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各类蛋白质的溶解度不同，因此可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方式称之为盐析。盐浓度通经常使用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。三、仪、材料、试（一）器制冰机，离心机（二）料幼嫩烟草叶片，离心管，枪头等。（三）剂PBSBuffer；饱和硫酸铵溶液

四、实步骤一、将叶片剪碎后加入mLPBS缓冲液，充分研磨样品；二匀浆的样品转移至mL的离心管μLmin；期间倒置混匀，以便蛋白质充分溶解；3、12000rpm离心min；4、将上清转移至新管中；五、若是上清中仍有杂质，12000g心15min有杂质，此步骤能够省略）六上清液入等体积的饱和硫酸铵溶液在能够看到白色的蛋白质析出，倒置混匀15-30