医学微生物学课件：实验课4 肠道杆菌

实验四肠道杆菌一、了解肠道杆菌的形态及染色性二、熟悉肠道杆菌的培养特性三、掌握肠道杆菌的生化反应特点

四、掌握血清学试验（玻片凝集、Widaltest）肠道杆菌的形态（革兰染色）粪便标本中沙门菌的分离与鉴定

粪便标本分离培养（SS、EMB/MAC、BAP）可疑菌落初步鉴定：TSI、KIA/MIU、IMViC多价血清（A-F分群）最后鉴定全套生化反应药敏试验报告结果说明：BAP，血琼脂平板；EMB，伊红美兰琼脂培养基；MAC，麦康卡琼脂；TSI，三糖铁琼脂；KIA/MIU，克氏双糖/动力试验,吲哚、尿酶试验管伊红美兰琼脂培养基（简称EMB）成分：肉膏汤琼脂（pH7.6）100ml磷酸氢二钾0.2g

乳糖 1g2%伊红水溶液（灭菌） 2ml0.5%美兰水溶液（灭菌 1ml功能：金黄色葡萄球菌不生长；大肠埃希菌菌落呈紫红色，有时呈现金属光泽；伤寒沙门菌菌落呈灰白色或无色。大肠杆菌（EMB培养基）肠道致病菌（EMB培养基）SS琼脂培养基成份：肉膏汤琼脂 100ml

乳糖 1g

胆盐 0.85g

枸椽酸钠0.85g

硫代硫酸钠 0.85g10%枸椽酸铁水溶液1ml1％中性红水溶液 0.25ml1％煌绿水溶液0.033ml功能：抑制大肠埃希菌的生长；伤寒沙门菌、福氏志贺菌生长良好。肠道致病菌（SS培养基）肠道非致病菌（SS培养基）铁质双糖琼脂培养基（简称KIkligleriron）成份：蛋白胨 2g

氯化钠0.5g

葡萄糖0.1g

乳糖 1g

枸椽酸铁铵0.05g

硫代硫酸钠0.075g

琼脂1.5g 0.2%酚红 1.25ml

蒸馏水100ml

肠道杆菌在KI培养基上的培养特性说明：C对照组；1肠道非致病菌；2志贺菌；3沙门菌；4/4A大肠杆菌；5变形杆菌。该培养基有助于肠道可疑细菌的初步鉴定，酚红为指示剂。当细菌分解乳糖大量产酸，会使培养基变黄色。如果只分解葡萄糖，产酸量少，只是试管底部变黄。如果产生硫化氢，与铁反应，生成黑色沉淀，培养基变为黑色。如果产酸产气，在试管底部产生气泡，可将培养基顶起。生化反应-单糖发酵(sugarfermentation)如：葡萄糖及乳糖发酵实验目的了解糖发酵试验方法

实验材料

菌种：大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌培养物

培养基：乳糖及葡萄糖发酵管

实验方法用接种环将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种于葡萄糖及乳糖发酵管中。

37℃孵育18~24小时，取出观察结果。溴甲酚紫[pH5.2（黄色）～6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。

生化反应——吲哚试验（indoletest）原理：有些细菌具有色氨酸酶，能够分解色氨酸生成吲哚，吲哚再与对二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚，呈现红色。方法：将待检菌接种至蛋白胨水培养基中，37℃培养1-2天，沿管壁徐徐加入柯凡克0.5ml，即刻观察结果。结果观察：液面交界处呈红色着为阳性，无红色者为阴性。菌名葡萄糖甘露醇乳糖靛基质甲基红VP试验枸椽酸盐硫化氢尿素分解动力福氏志贺菌++－－/++－－－－－伤寒沙门菌++－－+－－/++－+乙型副伤寒沙门菌⊕⊕－－+－－++－+大肠杆菌⊕⊕⊕++－－－－+产气杆菌⊕⊕⊕－－++－－+普通变形杆菌⊕－－++－－/+++++常见肠道杆菌的生化反应鉴别表动力检测血清学鉴定-玻片凝集

(一)实验目的与原理用已知抗体（诊断血清）鉴定未知抗原（待检病原菌）(二)实验材料1、抗体1:10稀释的痢疾杆菌诊断血清。2、抗原:待检病原菌24小时斜面培养物。3、其它:生理盐水、载玻片、接种环等(三)实验方法玻片凝集试验操作程序与结果方法：取一洁净载玻片，用接种环取待检菌培养物，分别与诊断血清和生理盐水混匀，轻轻晃动玻片数次。1-3分钟后观察结果。结果观察：阳性—待检菌明显凝集，对照菌均匀浑浊；阴性—待检菌与对照菌均浑浊。试管凝集-Widaltest(一)实验目的与原理用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙、丙型副伤寒杆菌H抗原，与患者血清作定量凝集试验，以检测患者血清中有无相应抗体，根据抗体含量及增长情况，可辅助诊断伤寒及副伤寒。(二)实验材料试管，吸管。生理盐水，病人血清，伤寒杆菌O抗原和H抗原，甲型、乙型、丙型副伤寒杆菌H抗原。(三)实验方法

取小试管30支，于试管架上排成5排，每排6支，并分别标记血清稀释度及种类于试管上。每支试管中分别加入生理盐水0.5ml。吸取1:10稀释血清2.5ml分别加入各排第1管中，每管0.5ml。于第1排第1管内用1ml吸管吸吹三次充分混匀，再吸出0.5ml到第2管作等倍稀释，并依次类推直至第5管为止。再从第5管吸出0.5ml弃去。后4排稀释方法相同。每排各管的血清稀释度分别为1:20，1:40，1:80，1:160，1：320。每排第6管不加血清，作为对照。加入抗原第1排各管加伤寒杆菌O抗原0.5ml；第2排各管加伤寒杆菌H抗原0.5ml；第3排各管加甲型副伤寒杆菌（A）抗原0.5ml；第4排各管加乙型副伤寒杆菌（B）抗原0.5ml；第5排各管加丙型副伤寒杆菌（C）抗原0.5ml。此时各管的病人血清稀释度又增加一倍，依次为1:40，1:80，1:160,1:320，1:640，每管总量1.0ml。轻轻振荡混匀，置37℃温箱中18～24h，取出观察并记录结果。观察结果：先观察对照管，应无凝集现象。再从各排第1～5管依次观察，以能出现明显凝集现象（＋＋）的血清最高稀释度，即为该血清对某种抗原的凝集效价。“H”抗原呈絮状凝集，“O”抗原呈颗粒状凝集。分别记录结果，并进行分析。O凝集价≥

1：80H凝集价≥

1：160副伤寒H凝