第二章第四节核酸类药物的生产

§2-4核酸类药物的生产核酸知识复习核酸药物的分类核酸类药物的生产方法核酸类药物的生产实例核酸类药物的检测思考题第一页，共二十七页。核酸知识复习核糖（核糖脱氧核糖）核苷嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）碱基核酸核苷酸嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（DNA、RNA）磷酸DNA和RNA是存在于细胞中的正常成分。DNA主要存在于细胞核中，少量（2%）存在于线粒体和叶绿体中；RNA主要存在于细胞质中，少量（10%）存在于核仁、核浆和染色体中。核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。第二页，共二十七页。一、核酸药物的分类（一）、具有天然结构的核酸类物质如：DNA、RNA、肌苷、ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、肌苷酸等。获得：微生物发酵或从生物资源中提取生产。药理功能：有助于改善机体的物质代谢和能量代谢平衡，加速受损组织的修复，促使机体恢复正常生理功能。著名企业：珍奥集团、GENTA公司第三页，共二十七页。珍奥集团

珍奥集团始创于1996年，是一家以保健品、药品和生物制品为核心业务，集研发、生产、销售于一体的健康产业集团，是国家级高新技术企业。珍奥集团位于大连市双D港，总占地面积近60万平方米，下辖大连珍奥药业有限公司、大连珍奥生物技术股份有限公司、上海珍奥生物科技有限公司、大连双迪生物科技有限公司、福建珍奥核酸有限、大连珍奥进出口有限公司等六家生产型控股子公司，现有药品、保健品、化妆品、功能性纺织品、核酸原料、健康整水系统等7大系列400多个品种，产品销往日本、美国、瑞士、英国、意大利、加拿大等近20多个国家和地区。第四页，共二十七页。珍奥集团

珍奥集团是中国最大的核酸产业化基地，是世界上唯一整合了核苷酸上下游全产品链的核酸企业，核酸原料国内市场占有率85%以上；珍奥核酸系列保健品经上海复旦大学、同济大学等多家国家权威部门指定的健康相关产品评价基地人群试食试验证实，功效确切，安全性高，产品畅销十几年不衰；珍奥核糖核酸（RNA）是目前世界上唯一通过GMA-SAFE（美国食品生产协会-食品优秀生产供方审核）认证的RNA产品，企业已受邀参与第一个食品用核糖核酸国际标准制定；珍奥5′核苷酸完全符合FCC（美国食品化学品法典）最新版标准要求，被多家世界顶级跨国公司用作食品添加剂，该项目被列为国家发改委振兴东北老工业基地项目。在医药领域，珍奥自主研发的国家一类新药——注射用心肌肽是“九五”国家重点科技攻关计划项目，“十五”国家重点科技专项863计划，已通过四期临床，获准新药证书并全面上市。

第五页，共二十七页。珍奥集团

珍奥集团与国内外十几家科研院所及上百位科学家建立了长期稳定的科研合作关系。包括国际免疫联合会前主席青克纳格尔博士在内的12位诺贝尔奖得主曾走进珍奥生命园，并对珍奥科研项目和科研实验活动进行了评价和指导。截至目前，珍奥集团拥有专利近百件，被评为“国家知识产权试点单位”。

珍奥集团贯彻“宁失一万，不失万一”的质量方针，严格执行健康食品和药品生产的国际安全准则，先后通过了ISO9001国际质量管理体系认证、HACCP国际食品安全预防控制体系认证、ISO22000国际食品安全管理体系认证、ISO14001国际环境管理体系认证、药品和保健食品GMP等认证。此外，珍奥还获得了美国FDA企业注册资格和产品通关检验，以及日本厚生省健康产品准入认证。第六页，共二十七页。一、核酸药物的分类（二）、天然碱基、核苷、核苷酸的类似物或聚合物如：三氟代胸苷、叠氮胸苷、拉米夫定（嘧啶类）、阿德福韦（嘌呤类）、恩替卡韦（第三代核苷类抗乙肝病毒药物）等。获得：由自然结构的核酸类物质通过半合成生产。药理功能：治疗病毒病如乙肝、肿瘤、爱滋病的重要药物，也是产生干扰素、免疫抑制剂的临床药物。第七页，共二十七页。二、核酸类药物的生产方法（一）核酸类药物的原材料除病毒外，所有的动植物组织中都含有核酸类物质，包括大分子DNA和RNA、小分子的核苷酸、核苷、碱基等成分，但不同的组织中含量有所不同。动物胸腺中DNA含量较多，是提取DNA的原料；酵母细胞中RNA含量最多，是提取生产RNA的主要原料。第八页，共二十七页。二、核酸类药物的生产方法（二）DNA和RNA的生产方法1、分离提取核酸的生产一般采用提取法，即从粉碎、破裂的生物组织细胞中通过一定的方法获取总DNA或总RNA。如需进一步的纯化，常用纯化方法如柱层析、凝胶电泳和密度梯度超离心。２、人工合成获取大分子核酸的另一方法是人工合成，即利用化学的方法按照设定的核苷酸顺序逐一加入形成核酸。现已有核酸合成仪，但合成长度还有一定限制，并且该仪器价格昂贵。因此这种方法一般用于研究，不适合生产。第九页，共二十七页。二、核酸类药物的生产方法（三）核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法酶解法、半合成法、发酵法1、酶解法生产酵母，从酵母中提取RNA，RNA经青霉菌属或链霉菌属等微生物产生的酶进行酶解，制成各种核苷酸。2、半合成法微生物发酵与化学合成并用。3、直接发酵法采用营养缺陷型菌株或营养缺陷型兼结构类似物抗性菌株来发酵大量生产目的核苷或核苷酸。第十页，共二十七页。三、核酸类药物的生产实例（一）DNA的生产技术1.提取原理在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物——核糖核蛋白（RNP）和脱氧核糖核蛋白（DNP），这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。RNA＋pro.→RNP（核糖核蛋白）DNA＋pro.→DNP（脱氧核糖核蛋白）0→0.14MNaCl溶液DNP溶解度逐渐降低，RNP的溶解度很大；0.14M→0.5MNaCl溶液DNP溶解度逐渐增加。在制备DNA时，可利用0.14MNaCl溶液使DNP与RNP分开。由于DNP在浓盐溶液中的溶解度比稀溶液大得多，所以，首先采用浓盐溶液（1～2M）尽量抽提DNP，然后再去除杂蛋白。第十一页，共二十七页。三、核酸类药物的生产实例2.工艺路线[抽提]猪脾脏[预处理]

冷冻，绞碎

组织浆液[预处理]

0.1MNaCl-0.5M柠檬酸混合液，离心沉淀1.71MNaCl

上清液（DNP）沉淀（DNP）溶解液0.14MNaCl沉淀物白色纤维状DNA10%NaCl上清液（DNA）氯仿-异戊醇95%乙醇真空干燥第十二页，共二十七页。三、核酸类药物的生产实例3.工艺过程取鲜猪脾,去脂、血,称取10g,用预冷的1×SSC溶液洗2次，剪碎。

按睥：1×SSC=1;5W/V加入50ml预冷的1×SSC，用高速组织

捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒。将匀浆液放在烧杯中，于冰盐浴中冷却30分钟。4000转/分钟离心10分钟。充掉上清。沉淀物中再加2倍体积的1×SSC搅匀，离心，弃上清，重复2次。将所得沉淀悬于5倍体积的PH8.0、0.15MNaCL—0.1Na2MEDTA溶液中。边搅拌边漫漫滴加5%SDS最终浓度达1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol/L，继续搅60分钟，以确保氯化钠全溶。所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿—异戊醇（24：1，体积比），激烈振荡20分钟，4000r离心20分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同积氯仿—异戊醇重复去蛋白2次。取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA纤维2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并挤干。第十三页，共二十七页。三、核酸类药物的生产实例（二）RNA的生产1、来源：微生物——酵母通常在细菌中RNA占5～25％，在啤酒酵母中占2.7～15％，在霉菌中占0.7~28%，面包酵母含RNA4.1～7.2％。酵母菌体提取优点：（1）收率高；（2）提取容易。第十四页，共二十七页。三、核酸类药物的生产实例２、RNA的提取——等电沉淀法酵母菌体提取液抽提清液RNA粗品RNA精品稀NaOH，提取中和，分离洗涤、干燥pH2.53、工艺过程（1）预处理：压榨、除水；（2）提取：0.13%NaOH，使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来；（3）中和、除菌体；（4）分离：等电点法，调pH2.5，使RNA沉淀下来；（5）洗涤、干燥第十五页，共二十七页。三、核酸类药物的生产实例（三）ATP制备腺嘌呤前体

腺苷AMPATP枯草杆菌160（Smr+Try－+Pur－）微生物或化学转化微生物枯草杆菌160（Smｒ+tyr－+pur－）菌株，在添加腺嘌呤（由丙二氰化学合成）的培养基上培养，可以大量累积腺苷。也可使用发酵法直接生产ATP，所用菌种是产氨短杆菌ATCC6872。第十六页，共二十七页。三、核酸类药物的生产实例（四）辅酶A的生产1.结构与性质是ADP的衍生物或类似物，相对分子质量为767.54.高纯度为白色无定型粉末，具典型硫醇味，有吸潮性，易溶于丙酮、乙醚和乙醇。兼有核苷酸和硫醇的通性，易被过氧化氢、碘或高锰酸钾等氧化失活成二硫化物，制剂需加稳定剂，最好充氮保存。第十七页，共二十七页。三、核酸类药物的生产实例（四）辅酶A的生产TCA，除蛋白新鲜猪肝【绞碎】

肝浆

【水，提取】提取液滤液GAM树脂GAM-CoACoA浓集液LD-601-CoACoA粉HCl-NaClCoA酸化液HCl，酸化LD-601，再吸附酸化浓缩液浓缩上清液沉淀物丙酮沉淀脱水干燥2.生产工艺第十八页，共二十七页。三、核酸类药物的生产实例（四）辅酶A的生产3.生化功能

提供机体能量辅酶A是体内70多种酶反应通路的辅助因子,包括糖类的分解,脂肪酸的氧化,氨基酸的分解,丙酮酸的降解,激发三羧酸循环,提供机体生命所需90%的能量.提供活性物质辅酶A参与机体大量必需物质的合成.在脑部合成神经肌肉信使和神经递质乙酰胆碱以及促进睡眠的褪黑激素（melatonin）等.神经肌肉信使可在神经和肌肉之间交换资讯,神经递质可在神经和大脑之间传递情感、外界刺激、记忆、学习等方面的资讯.传递酰基作用辅酶A是重要的乙酰基和酰基传递体.激活免疫作用辅酶A支持机体免疫系统对有害物质的解毒、激活白细胞、促进血红蛋白的合成、参与抗体的合成.促进结缔组织形成和修复辅酶A能促进结缔组织成分硫酸软骨素和透明质酸的合成,对软骨的形成、保护和修复起重要作用.其他作用辅酶A促进辅酶Q10和辅酶I的利用,减轻抗生素及其他药物引起的毒副作用.第十九页，共二十七页。四、核酸类药物的检测1、DNA含量测定DNA是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链，所以磷酸或戊糖的量正比例于DNA的量，可通过测定磷酸或戊糖的量来测定DNA的量，前者称为定磷法，后者称为定糖法。（1）定磷法磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，再转变为钼蓝，吸收峰在660nm。（2）定糖法——二苯胺法酸性条件下，DNA与二苯胺共热，生成蓝色化合物，吸收峰595nm。第二十页，共二十七页。四、核酸类药物的检测2、RNA含量测定（1）定磷法——660nm；（2）定糖法——地衣二酚（苔黑酚）法。盐酸水解RNA，使核糖游离出来，并生成糠醛，与地衣二酚反应呈蓝绿色，在670nm处有最大吸收峰。3、核苷酸、核苷含