上皮细胞相关标志物在角质形成细胞中的表达特征,细胞生物学论文

上皮细胞相关标志物在角质形成细胞中的表达特征,细胞生物学论文角质构成细胞是鳞状上皮细胞的主要组成成分，具有广泛的生物学特性。常见的鳞状上皮细胞有皮肤和口腔黏膜上皮细胞，当其出现大面积损伤时创口本身不能正常愈合，只能通过组织移植来补偿缺损的组织面。皮肤或口腔黏膜是容易接触一些药物或材料刺激的组织，因而讨论皮肤或口腔黏膜组织对于临床药物和材料的反响是重要的研究课题。体外细胞检测模型一般来自患者的原代培养细胞或来自肿瘤、遗传物质突变的转化细胞系，但原代细胞培养获得的细胞有限，传代后组织特异性也逐步丧失，且组织来源不同的原代细胞培养所得出的测定数据差异较大，不是毒理学研究的理想细胞；转化细胞容易获得并易于维持，稳定性高，可重复性好，但其具有肿瘤细胞的特性，例如生长失去控制、接触抑制丧失、细胞外形改变、核型异常等[1],也不是毒理学研究的理想模型，因而，急需建立新的外源性化合物安全性的评价模型。人胚胎干细胞〔hu-manembryonicstemcells,hESCs〕是健康和永生的单一胚胎细胞来源的人类样本，既可真实反映人类生物学特征[2],又可通过单一胚胎细胞无限增殖和定向分化到达样本高度标准化[3],可能成为预测受试物细胞毒性和遗传毒性的体外替代实验模型[4],为体外安全性评价提供了新的希望。将hESCs诱导分化为角质构成细胞当前暂无标准化方式方法，研究发现通过构成拟胚体〔embryonicbody,EB〕的方式方法获得的角质构成细胞增殖能力过低，不利于组织发育[5];2008年，Metallo等[6]用直接诱导法将hESCs诱导分化为上皮细胞的前体细胞，并比拟了EB法和直接诱导法诱导hESCs5周后获得的细胞角蛋白〔cytokeratin,CK〕14的阳性表示出率〔15%vs.87%〕,发现直接诱导法具有显著的优势。人永生化口腔上皮细胞系〔humanimmortalizedoralepithelialcells,HIOECs〕是用人乳头瘤状病毒E6、E7开放读码框架转染原代培养的正常口腔上皮细胞后建立的[7],HIOECs具有与口腔黏膜上皮细胞类似的形态和生化特性，所建模型可被用于评价药物在口腔吸收机制的研究[8].人永生化皮肤角质构成细胞HaCaT是由成人皮肤转染猴空泡病毒40〔simianvirus,SV40〕后发生自分化的未成瘤的永生化皮肤角质构成细胞系[9].本课题组前期实验亦通过直接诱导法将hESCs诱导分化为上皮样细胞[10],但尚不清楚所得到的上皮样细胞能否仍保持正常的染色体核型，其进一步分化是趋向于发展为皮肤上皮还是口腔黏膜上皮，以及能否作为将来毒理学的检测模型。本研究对得到的上皮样细胞进行了染色体核型的分析，在基因水平上讨论了由hESCs诱导K-hESCs经过中多能性标志物及上皮相关标志物的表示出变化；并以人原代牙龈上皮细胞〔humangingivalepithelialcells,HGECs〕、HIOECs和HaCaT作为对照细胞，通过实时定量荧光PCR方式方法检测了其诱导末期人胚胎干细胞源角质构成细胞〔keratinocytederivedfromhu-manembryonicstemcells,K-hESCs〕与对照细胞上皮相关标志物基因表示出的差异性；在蛋白水平上，通过免疫组织化学方式方法讨论了多种上皮细胞相关标志物在K-hESCs和对照细胞中的表示出差异。1材料与方式方法1.1材料研究所用明胶、Matrigel购自美国BD公司，胚胎干细胞完全培养基〔mTeSR1〕购自美国StemCell公司，中性蛋白酶购自德国Roche公司，CK、波形蛋白〔vimentin,VIM〕抗体购自美国SantaCruz公司，细胞培养瓶及培养皿购自美国Corning公司，通用型二步法检测试剂盒购自美国GBI公司，TritonX-100购自美国Amresco公司，Gimsa染液购自北京Solarbio公司；其他研究所用材料全部购自美国Invitrogen公司。1.2细胞培养1.2.1hESCs的培养人胚胎干细胞系H9〔H9-hESCs〕由新加坡国立大学提供，将其培养于Matri-gel上，培养液为胚胎干细胞完全培养基，天天换液，细胞接近汇合时用1g/L的中性蛋白酶，37℃消化5min,机械刮除，800r/min离心5min,1∶6传代。1.2.2HGECs的原代培养选择拟行阻生牙铲除术、无口腔黏膜疾病且冠周龈组织无炎症表现的患者，术前征得患者同意，术中收集铲除牙齿上附带的牙龈组织，采用组织块法在无血清上皮培养基〔de-finedkeratinocyteserum-freemediumandsupplement,D-KSFM〕中培养获得HGECs.本研究获得北京大学生物医学伦理委员会批准〔批准号：PKUSSIRB-202010055〕.1.2.3HIOECs及HaCaT培养分别使用D-KSFM和含10%〔体积分数〕血清的DMEM高糖培养基培养HIOECs与HaCaT,传代时均用胰酶37℃分别消化5min和1min,用含血清培养基中和，前者600r/min离心10min,后者1000r/min离心5min,1∶3传代。1.3诱导hESCs分化为K-hESCs.H9-hESCs常规传代后第2天，将hESCs完全培养基换成上皮分化诱导液〔体积分数98%的DMEM/F12培养基，含有1N2补充成分、1mol/L维甲酸、25g/L骨构成蛋白4〕,天天换液，连续诱导7天，第7天传代。传代时用1g/L的中性蛋白酶，37℃消化5min,机械刮除，D-KSFM重悬，200g离心4min,D-KSFM重悬轻吹匀，1∶3传代至明胶铺被的板子上，晃匀，隔天换液。P1代第10天时K-hESCs用胰酶37℃消化1min,含血清培养基中和，200g离心4min,D-KSFM重悬轻吹匀，1∶1传代至明胶铺被的板子上，晃匀，隔天换液。1.4Real-timePCR检测方式方法。Trizol法提取细胞总RNA,取2LRNA检测纯度和浓度，20L体系逆转录为cDNA,以GAPDH为内参，PCR引物序列见表1,20L体系在7500实时PCR检测仪〔美国ABI公司〕上行定量PCR检测。1.5免疫细胞化学检测将细胞均匀接种在无菌的载玻片上，待贴壁生长至适宜密度后，95%〔体积分数〕乙醇固定30min,PBS冲洗，0.1%〔体积分数〕Triton-X100室温处理15min,PBS冲洗；10%〔质量分数〕H2O2室温处理10min,PBS冲洗；滴加一抗，4℃过夜。第2天滴加二抗试剂，室温孵育30min,PBS冲洗；DAB室温显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。SOX2[SRY-relatedhigh-mobility-group〔HMG〕-boxprotein-2]、OCT4〔octamer-bindingtranscriptionfactor-4〕、CK1、P63以核内有着色颗粒为阳性判定标准，余以细胞浆内有着色颗粒为阳性判定标准。采用半定量分析断定阳性表示出强度，无着色颗粒或阳性细胞数少于5%为阴性〔-〕,着色且着色总面积在5%~10%为弱阳性〔+〕,着色总面积在11%-50%为中等阳性〔++〕,着色总面积大于50%者为强阳性〔+++〕.1.6二倍体检测生长状态良好的K-hESCs,参加0.012mg/L秋水仙素培养8h,收集细胞，参加预温至37℃的0.075mmol/LKCl溶液5mL,置37℃15min,用3∶1甲醇冰醋酸固定3次，滴到预冷的载玻片上，70℃3h烤片。Gimsa染色10min,水洗，显微镜下观察染色体并进行核型分析。1.7统计学分析利用SPSS16.0软件进行统计学分析，采用多组间比拟的单因素方差分析、成组设计多个样本比拟的秩和检验〔Kruskal-Wallis法〕及完全随机设计两独立样本的秩和检验分析方式方法，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1培养细胞形态和鉴定2.1.1细胞形态原代培养的HGECs呈铺路石样严密排列的上皮样细胞形态，细胞大小一致，形态规则，细胞核清楚明晰〔图1A〕;HIOECs为分散生长的多角形上皮样细胞，细胞大小较一致，生长较慢〔图1B〕;HaCaT细胞呈克隆状聚集生长，细胞为多角形，长满后也为铺路石样，生长较快〔图1C〕.未分化的H9-hESCs在Matrigel上细胞成团克隆状生长，饱满厚实，排列严密，形似鸟巢，细胞之间界线不清，胞体体积小，核大，有1个或几个核仁，细胞增殖并保持未分化状态〔图1D〕.用上皮分化培养基诱导得到的P1代细胞以组织块贴壁细胞为中心呈现克隆状生长，细胞呈铺路石状，排列严密；以小圆形、多角形为主的上皮样细胞，克隆的细胞较小且排列较严密，克隆周围的细胞较大且大小较一致，细胞核清楚明晰〔图1E〕,类似于HGECs,我们将其称为人胚胎干细胞源角质构成细胞K-hESCs.从P1代第8天开场，克隆周围的细胞开场收缩卷边，细胞变大、变长且细胞内出现空泡和颗粒，细胞间连接变稀疏，到第15天左右大多数细胞凋亡。P2代细胞贴壁量较少，分散生长，细胞增殖速度变慢，细胞形态改变，表现为胞体变大、核模糊、出现空泡、死亡脱落〔图1F〕.2.1.2细胞鉴定细胞免疫化学的实验结果显示，原代培养的HGECs,CK表示出阳性〔图2A〕,VIM表示出阴性〔图2B〕;H9-hESCs的SOX2及OCT4表示出阳性〔图2C和2D〕.9种上皮相关标志物在hESCs、K-hESCs〔P0代及P1代〕和HaCaT中的免疫组织化学染色结果见表2和图3.2.2Real-timePCR结果在H9-hESCs诱导为K-hESCs的经过中，胚胎干细胞多能性标志物OCT4和NANOG基因的表示出直线下降，角质构成细胞干性标志物CK18和p63基因的表示出整体呈现先上升后下降趋势，而CK14基因的表示出在P0代略微下降，在P1代呈不断上升趋势。H9-hESCs与P1代第7天时的K-hESCs相比，OCT4、NANOG、CK18、p63、CK14的表示出差异均有统计学意义〔配对t检验，P分别为0.016、0.023、0.011、0.030、0.013,图4〕.比拟角质构成细胞标志物p63、CK18、CK14在K-hESCs〔P1代第7天时〕、HGECs、HIOECs及HaCaT中的基因表示出差异。由图5可见，与K-hESCs相比，基因p63在HGECs和HIOECs中的表示出差异均无统计学意义〔P=0.245、P=0.439〕,但基因p63在HaCaT中的表示出远远高于K-hESCs〔P=0.036〕;CK18在K-hESCs中表示出最高，但与HGECs、HIOECs、HaCaT相比，差异并无统计学意义〔F=0.575,P=0.640〕;CK14在HGECs中表示出最高，与K-hESCs相比差异有统计学意义〔P0.001,且其在HIOECs和HaCaT中的表示出与K-hESCs相比差异亦有统计学意义〔P=0.001、P0.001〕.2.3二倍体检测K-hESCs染色体核型为正常女性〔46,XX〕,无构造异常〔图6〕.3讨论2006年诱导多能性干细胞〔inducedpluripotentstemcells,iPS〕的出现被以为有宏大的潜在应用价值，在建立体外病理模型方面有一定的方便性，但与胚胎干细胞相比，iPS要多经历分离、纯化、扩增、诱导去分化、挑选、建库、扩增等步骤才能诱导定向分化，这一体外经过复杂而漫长，细胞传代数过高对细胞的遗传稳定性、表观遗传特性和生物学特性都构成了极大的不稳定，iPS细胞即被证明带有本身的表观遗传印记和端粒异常，有数百个基因存在异常表示出[11-13].本文旨在建立健康安全评价检测模型，对细胞本身的正常性要求较高，因而，以为胚胎干细胞较iPS更具优势。上皮细胞主要包括上皮干细胞及其子代短暂扩大细胞、终末分化细胞。华而不实干细胞存在于上皮基底层，有无限的增殖潜能，正常情况下处于静止状态；短暂扩大细胞具有低的自我更新能力和高的终末分化可能性，短暂扩大细胞仅分裂增殖3~5次即到终末分化状态。处于不同分化阶段的细胞具有不同的表型。1整合素〔integrin-1〕的表示出是维持角质构成细胞未分化状态所需要的，1整合素能够区分角质构成细胞干细胞和短暂扩大细胞。Michel等[14]对CK19和1整合素进行研究后提出，细胞经染色后，若CK19和1整合素同时呈阳性且具有未完全分化状态特征的干细胞，则可视为角质构成细胞的祖细胞。P63主要与上皮细胞的分化和增殖有关，之前被以为是干细胞标志物，但近期的研究表示清楚，P63在体内不仅表示出于基底层而且还表示出于基底上层，即表示出于正在增殖的和有增殖能力的细胞[15],因而推断P63更应该是短暂扩大细胞而非干细胞标志物[16-18].CK18在细胞进入分化和复层前，持续地在单层细胞中表示出，有些细胞CK18的表示出下调被CK14取代[19].CK14早期表示出时可作为复层细胞的基底细胞标志物表示出于单层细胞上[19].CK10通常表示出于角化复层鳞状上皮的基底上层，即终末分化时将要角化的细胞，为角化标志，其表示出与上皮细胞角化状态密切相关。低相对分子质量CK〔AE1〕对腺上皮表示出敏感性较高，高相对分子质量CK〔AE3〕对鳞状上皮表示出敏感性较高。本研究诱导hESCs分化而成的K-hESCs呈现正常的46条女性染色体核型。Real-timePCR检测结果表示清楚，在基因水平上，单层上皮干细胞标志物CK18、短暂扩大细胞标志物p63的表示出呈现先上升后下降的趋势，复层上皮基底层标志物CK14呈现先略微降低后上升的趋势，提示K-hESCs经历了由hESCs向单层上皮干细胞分化继而转向复层上皮终末分化发展的趋势。免疫组织化学染色显示，K-hESCs在分化经过中，CK18、P63表示出先上升后下降，CK14表示出增加，与基因水平一致；除此之外，单层细胞表皮干细胞标志物CK19、1整合素的表示出增高，间充质细胞标志物〔上皮干细胞标志物〕波形蛋白〔VIM〕及角化标志物CK1、CK10的表示出增高，能够推断P1代第7天时K-hESCs正处于角化细胞祖细胞阶段，其鳞状上皮标志物AE3的免疫组织化学表示出高于腺上皮的标志物AE1的表示出，提示所得角化细胞祖细胞更偏向于鳞状上皮细胞的祖细胞。Real-timePCR检测结果显示，P1代第7天时K-hESCs上皮干细胞标志物CK18的基因表示出与HGECs、HIOECs、HaCaT相比差异无统计学意义〔P0.05〕,而复层上皮细胞基底层标志物CK14的表示出显著低于HGECs、HIOECs、HaCaT〔P0.01〕,提示P1代第7天时K-hESCs处于未完全成熟阶段。P1代第7天时K-hESCs的p63表示出与HGECs及HIOECs差异无统计学意义〔P0.05〕,而与HaCaT有明显差异〔P0.01〕,提示P1代第7天时K-hESCs可能更偏向于将来分化为口腔黏膜上皮。综上，本研究可在体外有效诱导hESCs分化为上皮样角质构成细胞K-hESCs,诱导所得P1代第7天时的K-hESCs具有正常核型，类似于单层鳞状上皮干细胞向终末分化初始阶段的角质构成细胞，该阶段细胞由上皮干细胞静止状态被激活，处于分化初始高增殖活力阶段，有望作为口腔临床药物的毒理检测模型。以下为参考文献[1]RolletschekA,BlyszczukP,WobusAM.Embryonicstemcell-derivedcardiac,neuronalandpancreaticcellsasmodelsystemstostudytoxicologicaleffects[J].ToxicolLett,2004,149〔1-3〕:361-369.[2]AmitM,CarpenterMK,InokumaMS,etal.Clonallyderivedhu-manembryonicstemcelllinesmaintainpluripotencyandprolifera-tivepotentialforprolongedperiodsofculture