怎样选择合适的液相色谱柱

HPLC色谱柱一、色谱分离模式——正相、反相、离子交换、离子抑制、亲水作用正相色谱是色谱的经典形式，使用极性固定相和非极性流动相。洗脱物通过其极性基团和固定相上的极性基团作用被保留。这种应用，经典的是使用未键合的硅胶和氧化铝，但现在使用的极性键合相有以下优点：键合相平衡快，对流动相中微量的水不敏感，和产生不同的选择性。二醇基键合相比纯硅胶极性小，平衡速度快；氰基键合相是保留能力最小的正相吸附剂；氨基键合相适宜分离芳香族碳氢化合物反相色谱已成为最流行的色谱分离模式。反相色谱中，固定相非极性，流动相极性。典型的流动相一般是水或水系缓冲液与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合物。典型的固定相是用脂肪烃硅完化的硅胶键合相，其它用于反相色谱的基质有石墨化碳和苯乙烯-二乙烯苯基质。反相色谱的性能还受残留的硅醇基的活性的影响。硅醇基与洗脱物的极性基团作用。因此，根据硅醇基的活性不同，填料显示出不同的选择性。而且，常能观察到碱性物质在硅醇基活性高的填料上产生拖尾峰。修饰硅醇基活性的一个办法是封端，即用硅烷化试剂把硅醇基转变成三甲基甲硅烷基基团。不过，即使是作了封端，基质表面的硅醇基密度还是比键合配基的密度大。硅醇基的活性也和硅胶的预处理（基质灭活）、硅胶纯度有关。碱性分析物的色谱分析推荐使用高纯度硅胶基质、充分封端的键合相。未封端的填料在许多应用中有可以获得不同选择性的优点。使用带有离子电荷的固定相，使根据洗脱物电荷进行分离成为可能。对于硅胶基质的离子交换填料，离子基团通过标准的硅烷化技术键合到硅胶表面。对于聚合物基质的离子交换填料，离子交换基团分布于交联聚合物的整体（throughthematrix）。有四种离子交换填料：强/弱阳离子交换填料和强/弱离子交换填料。弱离子交换填料的特征是电量与pH值有函数关系。以羧酸基为功能基的离子交换剂是弱阳离子交换剂的代表。弱阴离子交换剂由一级、二级、三级铵为功能基。大部分强离子交换剂的电荷与pH值无关。四级铵形成强阴离子交换剂，而磺酸基构成了强阳离子交换剂。所有这些离子交换基团都可以在聚合物基质上见到，主要用于分离生物大分子。除了弱阳离子基团外，其它功能基都可以键合到硅胶上。离子抑制（离子对）色谱广泛用于在低pH下分析洗脱液中的有机酸。它只是反相色谱的一个分支。特殊的聚合物固定相适用于这种应用，因为耐酸碱范围大。亲水作用色谱是正相色谱扩展到水系洗脱液。用极性固定相配合水-有机流动相。与反相色谱相反，保留随有机相的增加而增加。这种应用多用胺丙基键合相作固定相。当然，硅胶本身，二醇类或其他极性固定相也可以用。通常应用胺丙基固定相来分离碳水化合物。专门设计用于这种应用的柱子称为糖柱。图1分离模式的选择二、正相和反相色谱1.正相键合色谱法在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比K值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。2.反相键合相色谱法在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称ODS或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。.一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。表1正相、反相色谱对比表正相吸附色谱反相分配色谱极性大小固定相>流动相固定相<流动相固定相极性极性非极性流动相极性(己烷,庚烷)-非极性(甲,乙醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-极性化合物出峰顺序极性物质后出峰非极性物质后出峰三、液相色谱柱的性能相关的因素与液相色谱柱的性能相关的因素很多，基质（matrix）或者说担体、载体的化学性质、键合相（固定液）的化学性质、填料形状大小粒度分布、碳量和键合度等等。色谱柱填料可以由基质直接构成，如硅胶、氧化铝、高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或者甲基丙烯酸酯等等；也可以在这些基质的基础上涂布或化学键合固定液来构成，如：最经典的各种ODS柱、氨基柱、氰基柱等。1.我们先来看看各主要基质的特点：1)硅胶硅胶是陶瓷性质的无机物基质，刚性大，不易变形。化学性质较稳定，但对于水溶液尤其碱性水溶液仍然是不稳定的，即使表面经过良好的化学键合，覆盖了固定液，还是要注意水、碱性溶液、酸性溶液对硅胶的溶解作用，基质或者说是柱床（packedbed）溶解对色谱柱的影响是致命的。以硅胶为基质的填料构成了目前绝大多数的色谱柱填料。纯硅胶填料适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，硅胶也可以做凝胶色谱但柱效较低。硅胶基质键合固定相的高压液相填料，有其他填料无法比拟的高分离效能。2)二氧化铝二氧化铝和硅胶相似，但对水溶液、酸性碱性水溶液溶液更加不稳定。所以，极少用作键合固定相的基质，也是适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，尤其是分离芳香族碳氢化合物。酸性易离解的化合物容易在二氧化铝上形成死吸附。另外，氧化铝分离几何异构体能力优于硅胶。3)聚合物填料聚合物基质受压会变形，压力限度低但pH使用范围宽。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强，使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用强酸、强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。由于不耐压、有溶胀性，所以聚合物填料适宜用于大分子像蛋白质或合成的高聚物，另外还可以制成分子排阻、离子交换柱。近年发展迅速的大孔树脂，实际上主体就是苯乙烯-二乙烯苯聚合物或类似的合成高聚物。三种填料基质的pH值范围及缺点的对比表见表2。由于硅胶基质的绝对地位，以下主要以硅胶为例。表2三种柱填料基质的比较pH值范围缺点硅胶基质3-8高或低pH下，硅胶会溶解二氧化铝(Al2O3·nH2O)1-14化学修饰困难聚合物基质1-14孔结构复杂，孔径不均匀导致柱效不够高，有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损2.色谱柱的性质——对色谱分离的影响2.1物理性质：1)硅胶纯度（填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度）带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高（硅羟基的pKa低），会导致碱性化合物发生拖尾；金属含量低，硅羟基pKa高，碱性化合物不发生拖尾。2)色谱柱尺寸（填料床的长度和内径）短柱(15-100mm)-运行时间短，柱压低长柱(150-250mm)-分辨率高，运行时间长窄径柱(≤2.1mm)-检测器灵敏度高宽径柱(3-21.2mm)-载样量高3)颗粒形状（球形和无定形）基质要成为填料，首先要制成合适的形状和大小。硅胶形状有：薄壳型、无定形全多孔、球形全多孔，另外还有先做成微珠再堆积成球形全多孔的。通常只说不定形、球形。无定形全多孔的填料容易制备、价格低、粒度分布较均匀，但涡流扩散大，渗透性差，比较难填装出稳定的柱床，一般用来做制备柱。球形全多孔填料涡流扩散小，渗透性好；如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的话，具有传质阻抗小、载样量大的优点，柱效也更高。球形填料外形对称，比较容易填出稳定的柱床。填料的大小一般不能直接测量，因为填料粒度有一定分布范围，一般给出的大小只是用一定方法测得的表观大小。填料大小与柱效、柱压的关系为：柱效与填料大小成反比，柱压与填料大小的二次方成正比。所以，快速分析柱使用3微米粒度的填料、一般做成5厘米长，就是为了降低柱压；需要注意到降低粒度所得到的柱效增加跟不上柱压的增加快。基质做成合适的形状和大小后，可以通过各种化学修饰（modified）的手段，获得各种不同选择性的填料。有时候，我们增加柱长、降低填料粒度都无法把一个化合物分离的更好，这时候就要考虑使用选择性更好的填料。4)粒径（平均颗粒直径，通常3-10µm）填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，其表面积越大，填充柱的柱效超高；然而粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3pm的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小粒度的填料是很有用的。3µm填料填充柱的柱效比相同条件下的5pm填料的柱效提高近30%；然而，3µm的色谱柱的背压却是5µm的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短，以缩短分析时间。另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙睛代替甲醇，以降低色谱柱的压力。3µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品，而组份单一的样品多采用5µm的粒径。5)表面积（颗粒外表面和内部孔表面的总和，以m2/gram表示）高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力，柱容量和分离度。表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态，对于梯度淋洗尤为重要。6)孔径（颗粒的孔或腔的平均尺寸，范围80-300Å）大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间，达到充分分离，改善峰形。色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔，与孔内表面的键合相进行分离分配。样品MW≤4,000，选择80Å的孔径；样品MW>4,000，选择300Å的孔径。2.2化学性质：1)键合类型单体键合——键合相分子与基体单点相连，提高传质速率，加快色谱柱平衡；聚合体键合——键合相分子与基体多点相连，增加色谱柱稳定性，增加色谱柱的载样量。2)碳覆盖率（与基体物质相连的键合相的量）高碳覆盖率：提高分辨率，分析时间长；低碳覆盖率：缩短运行时间。3)封端（键合步骤之后，用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来）封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象；对于极性样品，未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异。2.3关于碳量和键合硅胶主要通过表面的极性硅醇基保留极性分子，属于正相分离模式。通过硅烷化技术，可以把各种不同性质的功能团（functionalgroup）建合到硅胶表面，例如：键合十八烷基（ODS，octadecylsilane）、辛烷基、甲基、苯基增加对非极性物质分子的保留，构成反相色谱；键合带二醇基、氨基、氰基等极性基团的硅烷改善对某些极性分子的保留，构成正相色谱；键合有醚基的键合相构成中等极性的正相或反相色谱；键合强酸性磺酸型或者强碱性季铵盐型键合相，构成离子交换色谱。对于硅胶反相键合相填料，键合的烃基，链长增加，载样量增大，k值增大，对非极性物质的保留时间延长。填料含碳量用元素分析来测量。通常，所得结果直接用来表示填料的碳量。在相同的硅胶基质上，相同的键合度，配基分子量越大，碳量越大；因此，C18固定相比C1固定相有更高碳量。相同配基，相同硅胶；覆盖率越高，碳量越大。对于相同配基，相同的表面覆盖率；填料的碳量随孔径的增加而减少，因为比表面积下降了。因此，我们可看到，只用碳量是不能衡量填料的保留性能的，所以要引入键合度概念。键合度有时候也叫做表面覆盖率。键合度是键合相表面组成的一个非常重要的量，也是决定填料的选择性的一个重要的参数。键合相是用有机硅烷与硅胶表面进行化学反应而产生的，目的是获得均匀的单分子层。在键合反应中可使用单功能基、双功能基和三功能基的硅烷，多功能基的硅烷可以获得更高的键合密度。填料的选择性决定于键合的密度。尤其是在分离碳水化合物时，不同键合密度表现出不同的选择性。多数商品键合柱属于单功能基的，单功能基的键合覆盖率更容易预测，因为不会有第二功能基产生复杂的副反应，用单功能基硅胶可以得到高的重现性，但是，硅胶表面键合单功能基硅烷比键合多功能基的更容易水解。三功能基硅烷在硅胶表面的键合，更难重现，折衷一下，键合二功能基，使得更耐水解。对于在高或低pH，易于水解的流动相中，最好使用耐用的多功能基键合硅胶。所有硅胶基质的离子交换填料都是三功能基的。如果氰基填料用于反相色谱，硅胶基质（低孔体积）的用三功能基硅烷较好。一些生产商会生产专门用于反相色谱的氰基键合相。对于许多反相填料，要进行二次键合以覆盖硅胶表面未被反应的硅醇基。通常使用小分子硅烷，如三甲基氯基硅烷（TMCS），以便获得最大的覆盖率。这个步骤称为封端（endcapped）。在反相色谱中，封端用于多数的键合相；用在正相或其他色谱的键合相一般不用封端。没有封端的反相色谱填料通常比封端的有复杂多样的选择性。但是，碱性物质在不封端的填料上，容易产生拖尾。三甲基硅烷基（封端基团）在酸性条件下容易水解。因此，对于不同的被分析物要按实际情况选择封端或者不封端的填料，封端的填料也不能在pH<2的条件下使用。四、液相分析小诀窍1.提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）2.减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）3.缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）4.减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）5.使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）6.使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）7.使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）8.改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度）9.改变有机相%，可增加柱效（提高灵敏度）10.改变键合相，可增加柱效（提高灵敏度）11.改变有机添加剂，可增加柱效（提高灵敏度）12.改变流动相配比方式，可增加柱效（提高灵敏度）五、反相高效液相色谱缓冲体系pH的选定反相高效液相色谱中缓冲体系pH值的选择在反相高效液相色谱分析中，选择正确的缓冲液pH值，对可离解的化合物分析的重现性十分重要，不恰当的pH值可能导致不对称峰，宽峰，分裂峰或肩峰，而尖锐的，对称的峰是定量分析中获得低的检测限以，两次分析之间较低的相对标准偏差（RSD）和保留时间的高重现性的前提。我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的pH值，以及如何选择正确的缓冲体系。1.什么时候需要缓冲溶液？在反相液相色谱分析中，流动相的pH值一般在2.5~7之间，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的pH值在2.5~7之外时，就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka在1~11之间，选择正确的缓冲液pH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的pH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。2.如何选择缓冲液pH值在选择缓冲液pH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个pH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：pH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液pH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得