单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3~5min。无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。.将洗好的脾脏用剪刀剪成3~5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。再以同样的方法洗涤离心一次。.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。注意事项：>免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。二、骨髓瘤细胞的准备：选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。制备细胞悬液，计活细胞数。调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。注意事项：常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10~20%。细胞的最大密度不得超过106个/mL。一般扩大培养以1:10稀释传代，每3~5天传代一次。细胞的倍增时间为16~20小时。一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞为确保该细胞对HAT的敏感性每3~6个月应用8~AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。三、细胞融合：.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合，加入20~50mLRPMI-1640培养液。.在1000r/min条件下离心8min,弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。.用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散。.将离心管置于37口水浴中，吸取1mL预热的50%PEG,缓慢滴入离心管内，30秒内加完，边加边轻轻搅拌，作用1~5min。.沿管壁滴加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL,2mL,3mL,4mL,5mL和10mL，同时边滴加边轻轻转动离心管。.800r/min条件下离心5~10min,弃上清。.将沉淀细胞轻轻混悬于含有20%的小牛血清的HAT选择培养液中，使细胞重悬。切记不能用力吹打,以免使融合在一起的细胞散开。.根据96/24孔板的数量，补加完全培养液，然后将上述细胞接种至含有饲养细胞的24孔板（每孔1.0-1.5mL）或96孔培养板（每孔0.10~0.15mL）。.接种完毕后，将上述培养板置于37口、5%CO2培养箱中培养。注意事项：冻存的骨髓瘤细胞在复苏后要2周时间才能处于适合融合的状态，培养目标是处于对数生长的时间尽可能长。饲养层细胞应在使用的前一天备好，这样才能分泌足够的细胞因子。杂交瘤细胞的选择性培养：一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。一般选择HAT选择培养液维持培养7~10天后，改用HT培养液。再维持2周后，可改用普通完全培养基。注意事项：经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2~3天要更换一半培养液。五、筛选分泌抗体的杂交瘤细胞：.包被抗原：将抗原以Na2CO3-NaHCO3缓冲液包被，使抗原浓度为10~20gL，加50~100匹/孔到96孔酶标板，4口包被过夜或37口包被2h,洗涤3次，拍干酶标孔内液体。同时，每板分别选取无细胞生长的两孔为阴性对照，另选取无细胞生长的两孔加入阳性血清作为阳性对照。检测血清或腹水效价时，对血清或腹水做倍比稀释，100匹/孔，以正常小鼠血清为阴性对照，37□孵育30min，洗涤3次，拍干。.封闭：每孔加200匹或加满封闭液（PBST溶解的1%BSA），于4□过夜或37口封闭2h后，洗涤3次，拍干，置4℃冰箱保存备用。.加抗血清：无菌条件下取细胞上清，每孔加入100gL不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37□孵育2h，弃去孔内液体，拍干。.加酶标二抗：加入PBST洗涤3次，每次5min，每孔加入100匹稀释后的HRP标记的二抗，37□孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。.显色：加入显色剂显色15~20min，待颜色最深时用终止液终止反应。.读数：在酶标仪A450上读出各孔OD值，选择出阳性孔。以各孔与阴性对照孔OD值的比值（P/M）大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。注意事项：在收集上清时，应在上次换液后3~4天进行，以便抗体积累。上清可不经稀释或1:5~1:10稀释后再测抗体活性，用稀释抗体进行筛选时可以筛掉弱阳性的抗体，也可以去掉因高本底所造成的假阳性。一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。融合后第一次筛选出的阳性克隆可能因阴性克隆或其他阳性克隆的过度生长而丢失，故应尽早亚克隆。第一次筛选后液可能没筛选到阳性抗体，这可能由于分泌阳性抗体的细胞为数尚少，应重复测定活性2~3次。不同的显色系统对应不同的光吸收值。六、杂交瘤细胞克隆化：制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）层。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，并计数。调整细胞数为3~10x103个/mL。取事先准备的有饲养细胞生长的96孔细胞培养板，把96孔板分为4组，每组24孔，将细胞悬液按倍比稀释法稀释成4组细胞，即每组12.5、25、50、100个/mL，每孔加入100匹稀释细胞，置于37口、5%CO2条件下进行孵育。8~9天时，肉眼可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。注意事项：＞初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。＞细胞融合后，一旦经鉴定可以产生目标抗体，就应立即进行克隆化，确保能分离出单个细胞重新形成克隆。＞应在克隆前1天制备好饲养细胞层。＞在第7天换液，以后每2~3天换液1次。＞阳性克隆细胞应尽快冻存。七、单克隆抗体的大量制备：.先腹腔注射0.5mL降脂烷或液体石蜡于BaLb/c鼠。.培养杂交瘤细胞，使细胞生长至对数期，将细胞转入50mL锥形离心管中，室温下1000r/min条件下离心5min。.将细胞重悬于50mL无菌的PBS或HBS（不含FBS中洗涤,1000r/min条件下离心5min,弃上清，重复2次，然后细胞重悬于5mL的PBS或HBSS中。.计数细胞，通过台盼蓝染色法确定细胞活力。.用不含FBS的HBSS或PBS调整细胞浓度至2.5x102个/mL。.小鼠预处理1~2周后，对Balb/c小鼠进行腹膜内注射2mL细胞。接种杂交瘤细胞7~10天后可产生腹水。.一只手抓住并固定小鼠，使其腹部绷紧，另一只手用滴管将腹水吸入试管中，或用注射器抽取腹水，可反复收集数次。.室温下，1500r/min条件下离心10min，收集上清，弃沉淀，将腹水存放于4口，直到收集腹水的工作完成。.再次收集腹水前，让小鼠再次积累腹水（2~3天），一般一只小鼠可获1~10mL腹水，将几天内收集到的腹水混合，并于56口水浴45min