生物碱的高效液相色谱分离分析和制备方法,有机化学论文

生物碱的高效液相色谱分离分析和制备方法,有机化学论文摘要：生物碱是天然产物中药用活性较好的一类化合物,在分离科学与技术领域,生物碱的分离一直是一个研究热门和难点问题。近年来,随着高效液相色谱填料和分离方式方法的发展,生物碱的分离分析和纯化制备有了长足的进步。该文主要针对碱性化合物的峰形拖尾问题,综述了高效液相色谱理论的发展和色谱分离技术的进步,以及近年来新型色谱填料和分离方式方法在生物碱分离分析和纯化制备中的应用,并对其前景进行了瞻望。本文关键词语：生物碱;拖尾;制备色谱;正交分离;Abstract：Alkaloidsareaclassofnaturalcompoundswithgoodpharmacologicalproperties.Inthefieldofseparationscienceandtechnology,alkaloidseparationhasalwaysbeenahotanddifficultproblem.Inrecentyears,withthedevelopmentofhighperformanceliquidchromatography(HPLC)materialsandseparationmethods,greatprogressesinalkaloidanalysisandpreparationhavebeenachieved.Inthisarticle,thetheoreticaldevelopmentandtechnologicaladvanceswithrespecttopeaktailingproblemsofbasiccompoundsaresummarized,andtheapplicationsofHPLCinnaturalalkaloidanalysisandpreparationarediscussed.ThefurtherdevelopmentofHPLCseparationonalkaloidsisalsolookedforward.Keyword：alkaloids;peaktailing;preparativeHPLC;orthogonalseparation;生物碱是天然产物中药用活性和成药性较好的一类化合物,据统计,美国FDA批准的1000多种小分子药物中,碱性药物的比例超过60%[1]。在当前已发现的天然产物中,生物碱在总数上固然只占16%,但在具有重要药理活性的天然产物中占50%,是天然产物新药开发中最具潜力的一类化合物[2]。从19世纪初开场,植物化学家就一直致力于生物碱的纯化制备,通过溶剂萃取、硅胶柱层析、结晶等植化手段获得了大量生物碱,并开发出诸多的碱性药物[2,3,4]。但由于传统技术的局限,对生物碱分离纯化往往收率很低,十分是含量较低的成分极易丢失,还有很多构造类似的生物碱,也由于分离度不够而无法获得纯品。高效液相色谱是在传统柱层析基础上,采用细颗粒的球形硅胶基质键合固定相和高压泵输液方式发展起来的具有柱效高、分离能力强、重复性好、速度快等系列优点的当代色谱分离方式方法,当前已成为药物分析、食品科学、生命科学等学科和产业领域不可或缺的重要分析工具[5]。随着分析型高效液相色谱的普及,制备型高效液相色谱也得到了越来越多的发展[6]。在天然产物领域,制备型高效液相色谱被广泛应用于黄酮、皂苷、生物碱等成分的纯化分离[7,8,9],十分是在构造类似物的分离中起到了重要作用,直接推动了很多新化合物的发现[10,11,12,13,14]。然而相比于其他类型天然产物,生物碱的分离往往会出现峰形拖尾和载样量十分低的情况,不仅在传统硅胶柱上死吸附严重,在高效制备填料上也仍然是令人头疼的问题[15,16]。由于峰形拖尾,生物碱往往峰宽较宽,峰高较矮,检测灵敏度较差,而提高进样量又会导致色谱峰拖尾加剧,柱效迅速下降,相邻的成分更易被拖尾峰包裹,这些问题给生物碱的分离分析和纯化制备带来了很多困难。针对像生物碱这样的碱性化合物的特殊色谱保存行为,研究者们从流动相和固定相上作了一系列探寻求索并获得了一定进展。本文将主要从碱性化合物的高效液相色谱峰形拖尾的构成机理和相应改善方式方法,以及实际应用,生物碱的分离分析和纯化制备进展等方面进行综述。1、碱性化合物峰形拖尾的内在机理讨论在过去几十年中,很多研究者对碱性化合物的色谱峰拖尾行为展开了研究并提出了相应的观点,华而不实主要有硅醇基理论、带电溶质互相排挤理论和多位点吸附理论。1.1、硅醇基理论硅醇基理论[17]是最早用于解释碱性化合物在硅胶基质固定相上拖尾现象的理论。该理论以为,硅胶基质外表残留的酸性硅醇基与碱性化合物之间的离子交换作用,是导致碱性化合物拖尾的主要原因。在C18等反相填料的键合经过中,由于空间位阻的存在,硅醇基往往不能完全反响,即便采用短链硅烷试剂进行封尾,仍有大量硅醇基未反响[15]。十分是在早期色谱填料制备经过中,使用了TypeA类硅胶基质,存在较多的金属离子残留,会进一步激发硅醇基的酸性,进而导致碱性化合物拖尾[18]。为此,色谱填料和色谱柱生产厂商通过改良球形硅胶基质的生产工艺,并发展了多种封尾技术[19,20]。随着高纯硅胶(纯度99.99%)和封尾技术的普遍应用,硅醇基的活性大大降低,如Neue等[21]以锂离子(Li+)的保存为指标对Waters公司的多种硅胶基质及其C18键合色谱柱的硅醇基酸性进行评价时发现,在pH3.0～7.0范围内,高纯硅胶基质反相色谱柱(SymmertryC18和XTerraMSC18)对锂离子均无保存,讲明其阳离子交换作用在酸性条件下几乎能够忽略。但在实际应用中,即便在这里类高纯硅胶色谱柱上开发碱性化合物的分析方式方法,仍经常需在流动相中添加磷酸盐等缓冲盐或其他试剂来改善峰形。另外,研究发如今不含硅醇基的聚合物色谱柱上,离子化碱性化合物仍然出现了拖尾和易过载现象[22](图1),而且在硅胶基质的反相色谱柱上,强酸性化合物也会表现出与碱性化合物类似的峰形拖尾和展宽现象[23],表示清楚生物碱的峰形拖尾显然还存在硅醇基以外的因素。图1中性化合物和碱性化合物的典型色谱载样行为差异[22]Fig.1DistinctoverloadingbehaviorsofneutralandbasiccompoundsontypicalRPLC[22]1.2、带电溶质互相排挤理论为进一步探究生物碱拖尾的机理,研究者们提出了带电溶质互相排挤理论[23]并采用单分子层Langmuir吸附模型作进一步验证和阐述[24]。该理论以为,相比于中性化合物,带有同种电荷的溶质在固定相外表存在互相排挤作用,使得固定相外表能够被吸附的位点数量减少,进而导致了其载样量的下降。这种理论能够在一定程度上解释碱性化合物在聚合物色谱柱的色谱保存行为,以及强酸性化合物在硅胶基质反相色谱保存行为。根据该理论,样品在非离子形态时具有最高的载样量,而在离子状态时载样量会下降。然而,此前的热力学研究表示清楚离子化合物与中性化合物的总吸附容量接近[25],这与单分子层的Langmuir模型矛盾,因而,离子型化合物的拖尾还存在其他因素。1.3、多位点吸附理论多位点吸附模型[26,27]是更准确严谨的解释离子型化合物拖尾的理论,相比于带电溶质互相排挤理论的单分子层吸附模型,该理论以为固定相外表还存在其他吸附能量不同的位点,这一方面解释了此前离子型化合物与中性化合物热力学容量相近的结果,另一方面提供了离子型化合物的动力学解释。该理论的主要观点是,碱性化合物的保存是多种吸附能量不同位点的共同作用结果,碱性化合物总是先占据数量较少的高能吸附位点,当高能吸附位点饱和后,才会去占据数量较少的低能吸附位点。相比于中性化合物,离子型化合物间的高低能位点间的能量差更大,由此可能导致离子型化合物传质均一性较差,并最终反映在色谱分离上更易出现过载和拖尾的现象。这些不同能量的吸附位点与他们所处的化学环境相关,华而不实少量的高能位点位于C18链内层,而大量的低能位点存在于C18链表层。该理论通过吸附等温线的测定,推导出了适宜的吸附模型,并从大量的色谱柱案例得到了验证,较为可靠,但到底为何会产生这种多位点的吸附,当前仍未有明确的结论,主要归因于材料外表的不均一性[28]。该理论主要由Guichon等[26,27,28]提出并反复验证,但国内关注者较少,国际上也较少有人据此提出相应的解决方案。根据该理论,降低生物碱对高能位点的吸附,是改善拖尾的一种手段。综上所述,碱性化合物在硅胶基质色谱柱上的特殊保存行为机理存在较复杂的因素,相关的机理讨论仍在不断完善中。2、改善生物碱拖尾的方式方法基于上述碱性化合物峰形拖尾问题的机理讨论,研究者们从流动相和固定相两方面提出了一系列改善措施,这些方式方法同样在生物碱的分离分析和纯化制备中得到了很好的应用。2.1、流动相方面为减少硅醇基和碱性化合物的离子交换作用,能够使用低pH值流动相以抑制硅醇基的电离,或使用高pH值流动相抑制生物碱的电离[29];可以参加有机胺改性剂(如三乙胺[30])竞争占据离子化硅醇基,进而阻断碱性化合物与硅醇基间的互相作用。除此之外,还可通过添加高浓度缓冲盐[31,32]、离子对试剂[33]或离子液体[34],以缓和溶质间的互相排挤,减少溶质与硅羟基的互相作用。这些添加剂的使用对分析水平上峰形的改善起到了一定的作用,但高浓度缓冲盐、离子对试剂和离子液体会导致更长的柱平衡和柱清洗时间,增大基线噪音,还会腐蚀仪器,影响数据质量。更重要的是,单纯改变流动相条件,并不能完全解决制备水平上的峰形拖尾问题,如低pH值流动相固然抑制了硅醇基的电离,但会促进生物碱的电离,当载样量增加时,峰形仍然会发生拖尾;除此之外,高pH值流动相虽可抑制生物碱的电离,但会造成硅胶的溶解,因而还需配合耐碱性的色谱柱。2.2、固定相方面通过改良固定相构造来克制碱性化合物拖尾是近些年研究的热门。随着硅胶制备工艺的发展,基于高纯硅胶的色谱柱逐步占据了主流。利用这类低硅醇基活性的色谱柱对碱性化合物进行分析,峰形优于早期硅胶。除此之外,通过一定程度的封尾或极性基团修饰,还能够进一步屏蔽活性硅醇基,进而获得更好的峰形。这类色谱柱的代表如Waters公司的SymmetryShieldRP18等。然而,这一类色谱柱通常只能在分析水平获得较好的峰形,载样量有限,且其pH值耐受范围有限。为知足碱性化合物在高pH值条件下分析的需求,各色谱柱厂家发展了一些更为先进的制造技术。如Agilent公司采用双封尾技术,研制了ZorbaxExtendC18色谱柱,可在碱性条件下较好地屏蔽硅醇基;Merck公司的LichrospherRP-selectB色谱柱,采用高密度键合方式,降低硅醇基暴露在流动相中的几率;迪马公司的SpursilC18色谱柱,在硅胶制造的最后阶段,在其外表移植了一层硅胶-有机层,进而保卫了内部的硅醇基,可以在碱性条件下使用。除此之外,Waters公司还提出了有机-无机杂化硅胶的概念,并推出了系列色谱柱,显着延长了色谱柱在碱性条件下的使用寿命,代表性色谱柱如XBridge系列[35,36]。需要指出的是,高pH值耐受色谱柱的发展,固然一定程度知足了弱碱性及中等碱性化合物的分离和制备,但由于碱性非常强的化合物(如季铵型生物碱等)即便在碱性条件下仍可保持正离子状态,而硅醇基由于在碱性条件下电离出负电荷,进而使生物碱与硅醇基间的离子交换作用加剧,导致碱性化合物的峰形反而更差[37]。图2XChargeC18色谱柱的外表化学构造[39]Fig.2ChemicalstructureoftheXChargeC18columnsurface[39]近年来,研究者们还设计了一些外表正电荷修饰的色谱柱,如Waters公司研制的外表带电杂化色谱柱CSH系列[38],以及本课题组设计的XChargeC18色谱柱[39,40](图2)。这类色谱柱改善碱性化合物峰形的机理在于色谱柱外表正电荷与碱性化合物溶质间的静电排挤作用,阻止了碱性化合物向硅醇基的靠近,进而改善了峰形[19]。可以用多位点吸附理论对其进行解释:外表正电荷的存在通过离子排挤作用,使碱性化合物不能接近在内层的高能吸附位点,而倾向于在C18链上的低能吸附位点吸附,进而使吸附和脱附变得均一同步,峰形也得到了改善[41]。相比于其他种类色谱柱,外表正电荷色谱柱优势明显:首先,它们对大多数类型碱性化合物均有较好的分离效果,即便是电荷性较强的季铵型生物碱,可以获得较好的峰形;其次,无需使用高浓度缓冲盐或离子对试剂,在低离子强度的挥发性缓冲盐或者简单的酸性条件即可获得较好的峰形,合适质谱分析;除此之外,在高载样量条件下,碱性化合物也能保持优异的峰形,特别合适制备。利用该类型色谱柱XChargeC18对富含季铵型生物碱的延胡索提取物进行分析,在简单的甲酸体系下,即可获得优异的峰形,而同条件下采用其他色谱柱分离时,峰形还是那样较差(图3)。尽管通过调节流动相添加剂如三乙胺或缓冲盐,生物碱在其他类型色谱柱也能到达较好的分离效果,但是这些添加剂往往不合适质谱分析,或者对载样量改善有限,不合适制备。图3延胡索提取物在不同反相色谱柱上的色谱图比拟[40]Fig.3ComparisonofchromatogramsofCorydalisyanhusuoextractondifferentreversedphasecolumns[40]a,b:XChargeC18column;c:ZorbaxEclipse5mXDBC18;d:Atlantis5mT3C18;e:XBridge3.5mC18;f:Xterra5mC18;g:inspire5mC18;h:spursilEP5mC18;i:TSKgel3mODS-100V;j:self-made5mC18/C1;mobilephase:0.1%formicacidwater(A)-CAN(B);gradientforXChargeC18:0-30min,0%-30%B;gradientforcommercialcolumns:0-30min,5%-35%B;30-40min,35%-60%B;injectionvolume:(a,c-j)50Land(b)100flowrate:1.0mL/min;columntemperature:30℃;UVdetection:254nm为了提供不同的选择性,包括本课题组在内的研究人员,还发展了离子交换色谱[42,43]、反相/离子交换混合色谱[44]。与传统的反相色谱相比,离子交换色谱和反相/离子交换混合作用色谱也能够为生物碱的分离提供良好的峰形和较高的载样量。这一类色谱柱的缺乏之处在于使用时通常需参加高浓度缓冲盐,会增加制备后处理的工作量。3、生物碱的高效液相色谱分离分析方式方法当前,生物碱的高效液相色谱分析方式方法主要包括反相色谱、离子交换色谱、亲水作用色谱以及相应的多维色谱。3.1、反相色谱法反相液相色谱是分析生物碱的最常用方式方法,该法依靠固定相和流动相间的疏水作用对中等极性和弱极性化合物进行分离。可供生物碱反相分析的固定相和流动相体系诸多,因而要注意它们间的互相配合以到达最优的分离效果。如使用常规C18色谱柱对生物碱进行分析,则需要调节流动相添加剂以改善生物碱的峰形。邹翔等[45]采用DiamonsilC18色谱柱,添加三乙胺并用磷酸调至pH3.0,分析了白屈菜不同器官中生物碱的种类及质量占比,获得了较好的线性关系、精致细密度和回收率。除此之外,近些年来,离子液体用作流动相添加剂来改善生物碱峰形多有报道,如朱益雷等[46]以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为流动相添加剂,采用UltimateXB-C18色谱柱,测定了香连丸中小檗碱、药根碱和巴马汀3种主要季铵型生物碱含量,并获得了比三乙胺更好的结果。当采用耐碱性的色谱柱时,流动相的pH值则能够调节至更高层次水平。林宏英等[47]采用ZorbaxExtend-C18色谱柱,以醋酸铵为添加剂,并用氨水调至pH8.0,质谱法鉴定了13个生物碱成分,并比拟了川乌加热前后生物碱的变化,具有较高的准确度和灵敏度。采用外表正电荷色谱柱并配合简单的低离子强度添加剂是近年来发展起来的一种新的分析方式方法。采用本课题组自主研发的XChargeC18色谱柱,Long等[48]在0.1%甲酸的条件下,采用HPLC/CAD对贝母中异构体生物碱进行定量分析,获得了良好的对称因子和灵敏度。Qing等[49]利用XChargeC18色谱柱对博落回生物碱进行液质联用分析,获得了良好的峰形,将该方式方法应用于不同基源药材的区分,也获得了较好的结果。Le等[50]采用XSelectCSHC18色谱柱,在10mmol/L甲酸铵条件下,对白毛莨中的生物碱进行了LC-ESIMSn分析,获得了良好的峰形,共鉴定出28个生物碱,华而不实包括一个新化合物和21个初次在该植物中被鉴定出来的化合物,该结果具体表现出了优异的色谱峰形对质谱鉴定的重要性。3.2、离子交换色谱法与中等极性和弱极性生物碱相比,强极性生物碱在反相形式下的保存更差,分离愈加困难,可采用阳离子交换(SCX)色谱法进行分析。刘琼等[51]选用SpherisorbSCX色谱柱,以不同离子浓度和pH值的磷酸盐溶液为流动相,分别对麻黄碱类、鲜益母草胶囊中的水苏碱、使君子药材中的胡芦巴碱、半夏露糖浆中的麻黄碱与伪麻黄碱进行了分析。本课题组Long等[43,52]评价了盐种类、盐浓度、pH值和乙腈浓度对几种强极性生物碱在SCX色谱柱上的峰宽和对称性的影响,并对其保存机理进行了讨论。图4亲水作用色谱对唐古特山莨菪馏分的分析[55]Fig.4AnalysisofalkaloidfractionsfromS.tanguticabyhydrophilicchromatography[55]mobilephase:acetonitrile(A)-100mmol/LNH4Cl(pH6.8)(B)-water(C);wavelength:210nm;flowrate:1mL/min;columntemperature:30℃;gradient:0-30min,90%-80%A,10%B,0%-10%C3.3、亲水作用色谱法亲水作用色谱能有效保存反相色谱中保存较差的强极性化合物,当前已被广泛应用于强极性生物碱成分的分析中。Taujenis等[53]用HILIC-MS/MS测定了烟草中4种生物碱,获得了较好的定量下限、回收率和准确度。卓荣杰等[54]采用AtlantisHILICSilica色谱柱分析了葫芦巴药材中的葫芦巴碱,获得了良好的分离效果和定量结果。本课题组龙珍[55]利用自制的亲水柱TE-Cys对山莨菪中强极性馏分进行了分析,样品得到了较好的保存和较好的峰形(图4)。图5SCX/XChargeC18二维体系分离分析山莨菪生物碱馏分[59]Fig.5AnalysisofalkaloidfractionsfromS.tanguticabySCX/XChargeC18[59]XChargeC18conditions:acetonitrile(A)-0.1%formicacid(B);gradient:0-30min,5%-15%A,95%-75%B;SCXconditions:acetonitrile(A)-100mmol/Lsodiumdihydrogenphosphate(pH2.8)(B)-water(C);wavelength:210nm;flowrate:1mL/min;columntemperature:30℃;gradient:0-20min,15%-50%A,30%-30%B,55%-20%C图6XChargeC18色谱柱(150mm4.6mm,5m)上延胡索生物碱样品的4个代表性制备色谱图[38]Fig.6FourrepresentativepreparativechromatogramsofthecrudealkaloidssampleontheXChargeC18column(150mm4.6mm,5m)[38]conditions:ACN(A)-0.1%aqueousformicacid(B);gradient:0-30min,5%-15%A;30-40min,15%-60%A;flowrate:1.0mL/min;UVwavelength:320nm;columntemperature:30℃;ioadingamount:10mg;injections:5th,10th,15thand20thfromtoptodown3.4、多维色谱法由于天然产物组成复杂,单维色谱中,大量的重叠峰会给定性定量带来不利的影响。相比于一维色谱,二维色谱能够为复杂体系提供更好的峰容量和更高层次的分辨率,是复杂体系分离分析的重要工具[56]。在已有的生物碱分离体系中,外表正电荷色谱柱凭借分离生物碱的优异性能,常被用于二维体系的构建。Wei等[57]发展了pH值正交的全二维反相色谱法用于延胡索生物碱的分析,第一维采用了峰容量较低的耐碱性色谱柱XBridgeRPC18,以1%氨水为添加剂,第二维采用了峰容量更高层次的外表正电荷修饰的XChargeC18色谱柱,以0.15%甲酸为添加剂,该二维体系获得了9095的峰容量。利用本课题组发展的一系列色谱柱,张敬彩[58]利用反相色谱、离子交换色谱和混合色谱不同的作用机理,针对千层塔生物碱提取物,分别构建了XChargeC18/XaquaC3、XChargeC18/XChargeSCX、XChargeC18/C18WCX3种不同形式的二维分离方式方法,并获得了较好的正交度。本课题组Long等[59]利用反相色谱、离子交换色谱、亲水色谱的不同机理,选择构造类型不同的21种标准品,采用实验室自制的系列色谱柱和Waters公司的XBridgeC18,构建并评价了XChargeC18/SCX、XChargeC18/XBridgeC18、XChargeC18/TE-Cys3种二维体系,并最终将XChargeC18/SCX二维体系用于山莨菪生物碱的分析和制备(图5)。高正交二维分离体系的建立是微量、难分离的生物碱化合物高效制备的前提和基础。4、生物碱的高效液相色谱纯化制备方式方法生物碱纯化制备的目的在于高效率地获得构造新颖的新化合物,为新药研发提供先导化合物。生物碱的分离在传统植化领域一直是较难的对象,十分是死吸附会导致最终样品的收率低。随着高速逆流色谱的发展,很多学者也尝试采用该方式方法来纯化生物碱类样品,并得到了较高的回收率[60,61,62,63]。但高速逆流色谱的分辨率较低,一次通常只能用于几个主要成分的制备,对于生物碱样品的系统分离,十分是含量较低的生物碱的获得还存在较大困难。而在普通制备液相色谱中,增加上样量后,生物碱的峰形拖尾加剧且极易降低分离度。而本课题组针对性发展的系列填料,不仅在生物碱的分析中获得了很好的应用,还可用于天然生物碱的纯化制备中,为微量、难分离的生物碱制备提供了一种解决方案。本课题组Wang等[38]采用外表正电荷XChargeC18色谱柱,以0.1%甲酸为添加剂,在分析柱上即完成了延胡索提取物中2种生物碱的纯化,具有较高的载样量、回收率和重复性(图6);此后,他们将该体系进一步放大,最终发现了具有镇痛作用的去氢紫堇球碱[64]。除此之外,采用强阳离子交换柱(SCX)作为第二维纯化的方式方法,从延胡索提取物中获得了-阿片受体冲动剂N-甲基四氢小檗碱[65]。本课题组Long等采用强阳离子交换柱(SCX)和外表正电荷XChargeC18色谱柱,从唐古特山莨菪中分离出了包含新化合物在内的一系列纯度较高的化合物[59,66]。将该方式方法应用到唐古特山莨菪活性导向的化合物追踪中,Du等[67]发现了6个具有M3受体拮抗活性的托品烷类生物碱,华而不实也包括新化合物,表示清楚该方式方法在发现未知活性化合物方面潜力宏大。Li等[68]采用正相-反相二维色谱对荜拔中生物碱进行了纯化制备,以正相作为第一维,采用本课题组发展的XAmide柱,反相作为第二维,采用Waters公司的AtlantisT3柱,该二维体系获得了58.3%的正交度,分离并鉴定出28个纯度较高的酰胺类生物碱,部分生物碱的质量到达克级。在上述生物碱的正交分离系统中,两维均采用了不同的机理,正交性好,使二维系统的分离能力得到较充分地发挥,因此能够高效率地制备出难分离的生物碱化合物。5、展望高效液相色谱技术在生物碱的分离分析和纯化制备中具有广阔的发展前景。尽管生物碱的高效分离分析方式方法已经获得了较大进步,但其高效液相色谱制备体系仍需不断完善。针对生物碱的高效制备问题,设计和制备一些构造不同的新型固定相,获得优异的峰形和载样量仍然是生物碱纯化制备的一个重要发展方向,比方:正相色谱与反相色谱具有很好的正交性,可作为生物碱正交分离方式方法的补充,然而在实际对生物碱的分离中,正相色谱重现性差,峰形易前展或拖尾,保存时间随进样量漂移,较少用于生物碱的制备。假如能够解决正相色谱的这些问题,将能够为生物碱的制备体系提供很大的补充。除此之外,能够用于强碱性生物碱的高效制备体系也比拟缺乏,当前比拟成熟的只要外表正电荷色谱柱体系,尽管阳离子交换SCX体系可以用于季铵型生物碱的制备,但该体系需使用大量的缓冲盐。因而,需发展相应的固定相,解决季铵型生物碱的正交分离问题。综上所述,制备型高效液相色谱的发展和推广对加速天然生物碱的发现具有重大意义,多维正交分离的方式在复杂生物碱的分离上表现出良好的前景,相信随着新技术和新方式方法的发展,高效液相色谱技术将在生物碱的分离制备领域具有愈加广阔的应用空间。以下为参考文献[1]WishartDS,KnoxC,GuoAC,ShrivastavaS,HassanaliM,StothardP,ChangZ,WoolseyJ.NucleicAcidsRes.,2006,34(S1):668-672.[2]CordellGA,Quinn-BeattieML,FarnsworthNR.Phytother.Res.,2001,15(3):183-205.[3]CushnieTP,CushnieB,LambAJ.Int.J.Antimicrob.Ag.,2020,44(5):377-386.[4]AmirkiaV,HeinrichM.Phytochem.Lett.,2020,10(16):xlviii-liii.[5]ShiXZ,LiGK,LiangZ,GuoZM,YeML,YanJY,XuGW.Chem.Bull.(石先哲,李攻科,梁振,郭志谋,叶亮堂,闫竞宇,许国旺.化学通报),2020,77(7):720-730.[6]LiRP,HuangJX.Process.Chem.(李瑞萍,黄骏雄.化学进展),2004,16(2):273-283.[7]SticherO.Nat.Prod.Rep.,2008,25(3):517-554.[8]BucarF,WubeA,SchmidM.Nat.Prod.Rep.,2020,30(4):525-545.[9]McchesneyJD,RodenburgDL.Curr.Opin.Biotech.,2020,25(1):111-113.[10]ZhangH,WangSS,LiW,WangYQ,XueXY,LiangXM.WorldSci.Technol.(张慧,王世盛,李伟,王亚琴,薛兴亚,梁鑫淼.世界科学技术),2018,11(2):253-256.[11]JinHL,ZhaoJQ,ZhouWJ,ShenAJ,YangF,LiuYF,GuoZM,ZhangXL,TaoYD,PengXJ,LiangXM.Rsc.Adv.,2021,5(76):62134-62141.[12]ZhaoYY,GuoZM,ZhangXL,LiangXM,ZhangYK.J.Sep.Sci.,2018,33(9):1224-1230.[13]LiXL,HuangRQ,LiuYF,JinHL,WanHH,ZhaoJQ,ZhaoWJ,LiangXM.Anal.Methods,2020,6(14):5183-5190.[14]LiW,WangSS,FengJT,XiaoYS,XueXY,ZhangH,WangYQ,LiangXM.Magn.Reson.Chem.,2018,47(10):902-908.[15]MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2018,1217(6):858-880.[16]ZhangJ,JinY,LiuYF,XiaoYS,FengJT,XueXY,ZhangXL,LiangXM.J.Sep.Sci.,2018,32(9):1401-1406.[17]StadaliusMA,BerusJS,SnyderLR.LCGCN.Am.,1988,6(6):494-500.[18]NawrockiJ.J.Chromatogr.A,1997,779(1/2):29-71.[19]HuangXJ,YangXL,LiuXL,WangJD.Chem.Reagents(黄晓佳,杨新立,刘学良,王俊德.化学试剂),2001,23(2):77-81.[20]O?sullivanGP,ScullyNM,GlennonJD.Anal.Lett.,2018,43(10/11):1609-1629.[21]MndezA,BoschE,RossM,NeueUD.J.Chromatogr.A,2003,986(1):33-44.[22]BuckenmaierSMC,MccalleyDV,EuerbyMR.Anal.Chem.,2002,74(18):4672-4681.[23]H?gglundI,St?hlbergJ.J.Chromatogr.A,1997,761(1/2):3-11.[24]NeueUD,WheatTE,MazzeoJR,MazzaCB,CavanaughJY,XiaF,DiehlDM.J.Chromatogr.A,2004,1030(1/2):123-134.[25]MccalleyDV.Anal.Chem.,2006,78(8):2532-2538.[26]GrittiF,GuiochonG.Anal.Chem.,2004,76(16):4779-4789.[27]GrittiF,GuiochonG.J.Chromatogr.A,2005,1095(1/2):27-39.[28]GrittiF,GuiochonG.Anal.Chem.,2005,77(4):1020-1030.[29]DaviesNH,EuerbyMR,MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2006,1119(1):11-19.[30]LiuL,FanZC,ZhangZQ.Chin.J.Pharm.Anal.(刘岚,范智超,张志琪.药物分析杂志),2018(2):236-239.[31]GrittiF,GeorgesG.J.Chromatogr.A,2004,1033(1):43-55.[32]MccalleyDV.Anal.Chem.,2003,75(14):3404-3410.[33]LiuXX,PanY,WangL,LiuLJ.Chin.Phar.J.(刘学湘,潘扬,王丽,刘亮镜.中国药学杂志),2018,45(9):698-701.[34]WangY,TianML,BiWT,RowKH.Int.J.Mol.Sci.,2018,10(6):2591-2610.[35]ChengYF,WalterTH,LuZL,IranetaP,AldenBA,GendreauC,NeueUD,GrassiJM,CarmodyJL,O?garaJE,FiskRP.LCGCN.Am.,2000,18(11):1162-1173.[36]DaviesNH,EuerbyMR,MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2008,1178(1/2):71-78.[37]WangCR,GuoZM,ZhangJ,ZengJ,ZhangXL,LiangXM.J.Sep.Sci.,2018,34(1):53-58.[38]FallasMM,BuckenmaierSMC,MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2020,1235:49-59.[39]WangCR,GuoZM,LongZ,ZhangXL,LiangXM.J.Chromatogr.A,2020,1281(6):60-66.[40]GuoZM,WangCR,LiangT,LiangXM.J.Chromatogr.A,2018,1217(27):4555-4560.[41]GrittiF,GuiochonG.J.Chromatogr.A,2020,1372:42-54.[42]FlanaganRJ,HarveyEJ,SpencerEP.Forensic.Sci.Int.,2001,121(1/2):97-102.[43]LongZ,WangCR,GuoZM,ZhangXL,NordahlL,LiangXM.J.Chromatogr.A,2020,1256(18):67-71.[44]DaviesNH,EuerbyMR,MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2007,1138(1/2):65-72.[45]ZouX,FangYN,QuZY,ShiX,LiuX,WangB,ChenM.J.HarbinUniv.Comm.:Nat.Sci.Ed.(邹翔,方月妮,曲中原,石鑫,刘欣,汪波,陈敏.哈尔滨商业大学学报:自然科学版),2021,32(3):257-260.[46]ZhuYL,FangHH,WeiHZ,LiuSN,DuanYQ,GongM,RaoY.Chin.J.Exp.Tradit.Med.Form.(朱益雷,方海红,魏惠珍,刘晟楠,段奕倩,龚明,饶毅.中国实验方剂学杂志),2021,(12):75-78.[47]LinHY,SuC,DuanTX,HuangJM,SunYK,WangY,JiJJ,DongJ,LiuYG.Mod.Chin.Med.(林宏英,苏畅,段天璇,黄建梅,孙毅坤,王玥,冀娇娇,董洁,刘永刚.中国当代中药),2021,17(3):208-211.[48]LongZ,GuoZM,AcworthIN,LiuXG,JinY,LiuX,LiuL,LiangL.Talanta,2021,151(5):239-244.[49]QingZX,LiuXB,WuHM,ChengP,LiuYS,ZengJG.Anal.Methods,2021,7(5):1866-1871.[50]LePM,MccooeyeM,WindustA.Anal.Bioanal.Chem.,2020,405(13):4487-4498.[51]LiuQ,JiangSY,TianSJ.Chin.J.Mod.Appl.Pharm.(刘琼,姜舜尧,田颂九.中国当代应用药学),2004,21(1):64-67.[52]LongZ,GuoZM,XueXY,ZhangXL,NordahlL,LiangXM.Anal.Chim.Acta,2020,804:304-312.[53]TaujenisL,OlsauskaiteV,PadarauskasA.ActaChromatogr.,2021,27(2)