流行病学第十六章分子

分子流行病学MolecularEpidemiology第十六章第一节概述第二节研究内容第三节研究方法第四节发展与应用前景目录第一节概述

产生与发展历程分子流行病学定义与传统流行病学关系一、产生与发展历程产生背景疾病防治中新问题①传染性疾病病原体变异与疾病预防控制抗生素与耐药新发现传染病

第一节概述②慢性非传染病多病因、多阶段、多基因、长潜隐期暴露——发病（死亡）关系③人群易感性遗传和环境不同导致易感性差异传统流行病学无法有效测量④实验医学病因假设和防治措施的人群检验第一节概述

分子生物学的发展①理论突破

DNA双螺旋结构、遗传中心法则、RNA逆转录等②技术创新凝胶电泳技术、分子杂交、基因克隆等第一节概述

发展历程概念演变

国外

1972年，提出“流感分子流行病学”

1977年，提出应用精细技术进行生物材料流行第一节概述病学研究

1986年，核心是运用实验室方法和分析流行病学，查明环境和宿主病因

1993年，提出流行病学中应用生物标志或生物学测量的功能定义

1996年，测量作为暴露和效应的生物标志即信息大分子如DNA、RNA和蛋白质第一节概述国内

1988年，从基因水平分析病原体特征，解决传染源和传播途径等流行病学问题

1992年，从分子至基因水平上研究医学事件分布及其决定因素和调控手段的学科第一节概述血清流行病学(seroepidemiology)

应用血清学方法对血清中各种成分（包括抗原、抗体、生化物质等）的分布情况进行研究，以阐明疾病及健康状态在人群中的分布及其影响因素，并在采取预防措施后应用血清学方法来考核其效果。基于血清中生物标志，可列入分子流行病学的范畴。

第一节概述

人类基因组流行病学

（humangenomeepidemiology,HuGE）将流行病学与基因组学相结合，研究人群中基因组信息与疾病和健康状态的关系。基于核酸生物标志的分子流行病学。第一节概述

分子流行病学现状①研究内容更加丰富②研究手段越来越多③应用范围不断扩大第一节概述二、分子流行病学定义研究人群中疾病/健康状态相关生物标志的分布及其影响因素、医学相关生物群体特征及其与人类疾病/健康的关系，制定防治疾病、促进健康的策略与措施的科学第一节概述

定义注释解决疾病或健康状态生物标志分布等流行病学分支学科研究对象人群、医学相关生物群体等

第一节概述

研究内容

疾病和健康状态相关生物标志的分布规律，生物标志与疾病和健康关系，以及其影响生物标志分布的因素医学相关生物的群体特征、与人类疾病和健康的关系制定和评价防治疾病、促进健康的策略和措施特征生物标志和群体分布第一节概述

三、与传统流行病学关系健康者

“海平面”

图16-1疾病的“冰山现象”亚临床者患者第一节概述

健康

疾病主观感觉客观指标健康指标疾病指标

模式I

暴露因素┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━┳━━━━┓

健康态←→潜在疾病态←→临界疾病态←→亚临床态←→临床态

┗━━━━┻━━━━━╋━━━━━┻━━━━┛

机体易感性因素模式II图16-2健康－疾病连续带示意图第一节概述亚健康态←→潜在疾病态←→健康态←→临床态亚临床态←→临界疾病态←→A暴露█████

疾病

┗━━━━┳━━━━┛

易感性分子流行病学B暴露内暴露早期生物学效应结构和功能变异临床疾病┗━━━┻━━━┳━━━┻━━━━━━━┛

易感性

暴露内暴露早期生物学效应续发生物学效应健康状态

┗━━━┻━━━┳━━━┻━━━━━━━┛易感性

图16-3传统流行病学与分子流行病学的关系传统流行病学第一节概述

第二节研究内容生物标志暴露测量效应测量易感性测量疾病防治效果评价一、生物标志种类暴露生物标志(exposurebiomarker)

定义

与疾病/健康状态有关的暴露因素的生物标志①外暴露标志(externalexposuremarker,EEM)②内暴露标志(internalexposuremarker,IEM)③生物作用标志(biologicallyactivemarker,BAM)第二节研究内容

效应生物标志(effectbiomarker)

定义

指宿主暴露后产生功能或结构性改变的生物标志

早期生物效应标志(earlybiologicaleffectmarker,EBEM)

结构和功能改变标志

(alteredstructureandfunctionmarker,ASFM)

病理标志(pathologicalmarker,PM)

临床疾病标志(clinicaldiseasemarker,CDM)

健康状态标志(healthconditionmarker,HCM)第二节研究内容

易感性生物标志(susceptibilitybiomarker)

定义指在暴露因素作用下，宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志

易感性与宿主的遗传特征、生长发育、营养等有关。宿主在不同疾病阶段，可以具有不同的易感性标志。第二节研究内容

生物标志选定生物标志的筛选①研究目的②候选生物标志特征的意义③检测方法的有效性第二节研究内容

生物标志特性①分子特性②时相特性③个体内变异④个体间变异⑤群体间变异⑥储存变异

第二节研究内容传统流行病学流行病学+分子生物学分子流行病学暴露疾病前瞻性研究回顾性研究暴露内剂量生物学效应剂量早期生物学效应结构和功能改变疾病预后易感性标志相应的检测方法四、分子流行病学主要研究内容

（一）病因的探讨及病因致病机制的研究1、传染病病因及流行规律的探讨（1）研究已知传染病的病原体和流行特点质粒图谱分析限制性内切酶图谱分析核酸杂交试验寡核苷酸图普分析

RNA阶段电泳PCR技术

E.sakazakii菌株的质粒分析（Muytjens，1983）菌株来源医院质粒分子量（Md）患者1A34患者2A70，39患者3A70，37患者4A70，37患者5A70，37患者6B及D98患者7C及D100，24患者8E98，40饭食1*A98，40，6.8饭食2A98，40，6.8饭食3A98，40，6.8餐具

A61，34注：*饭食1，2是在患者发病后2天采样分离的，3是3个月后分离的。餐具是在饭食3采样后2周分离的。

（2）研究新发现传染病的病原体和流行特点

庚型肝炎病毒（HGV）

分离病毒研究分布特点和传播途径观察病毒在体内持续的时间心肌炎用PCR方法对3例心肌炎患者尸检心肌标本进行肠道病毒检测，均为阳性，而脑外伤的对照组均为阴性

2、非传染病的病因及病因致病机制的研究

（1）心脑血管病的研究

载脂蛋白基因突变与高血脂症

四组老年人apooA-I、apoB-100与apoA-I/apoB-100比值人群类别检测例数apoA-I（mg/dl）apoB-100（mg/dl）apoA-I/apoB-100对照组85148.2±30.197.3±28.31.58±0.8冠心病组146141.6±51.9113.9±35.8**1.40±0.7**高血压组90135.1±32.9*107.0±59.2**1.44±1.07**高血压并冠心病组57140.2±31.3110.9±34.2**1.41±0.8**注：病例组与对照组相比*P<0.05；**P<0.01LDL受体基因突变与高胆固醇血症大片段碱基插入或缺失、单个碱基置换等，使LDL受体数量减少或功能障碍—LDL-C水平升高,早发冠心病和心肌梗死基因突变与高血压平滑肌细胞内DNA的含量较对照大鼠约高5%平滑肌细胞内myc癌基因表达较对照大鼠高50-100%Fos基因经HindIII、PstI和EcoRI三种酶切高血压大鼠1.6、3.4和4.0kb对照大鼠2.1、4.1和4.6kb高血压病人的fos基因经EcoRI酶切后的片段（5.4kb）明显短于正常人（6.9kb）（2）肿瘤的研究癌基因（oncogene）—sis、src、ras、myc、myb、fos、ski、yes、fgr、fps、fes、mosras基因慢性浅表性胃炎17.34%慢性萎缩性胃炎41.2%胃溃疡46.15%胃癌77.78%随着致癌因素的增加，某些基因的表达量也增加，因而使肿瘤的发病风险增加燃煤量与GSTM1基因型与肺癌之间的0R值和95%CI

燃煤量（吨）GSTM1/+型0型＜1301.01.8(0.8-4.1)≥1301.8(0.7-4.6)5.2(2.1-12.6)E2诱发催乳素瘤形成的分子机制涉及原癌基因c-myc、c-ras和催乳素基因的高效表达，其中，催乳素基因是“主效基因”，由催乳素基因的高表达诱发c-myc、c-ras基因的高表达

17-b-雌二醇

催乳素基因c-rasc-myc主效基因肿瘤抑癌基因（tumorsuppressorgenes）—RB1、p53、WT1、NF1、NF2、DCC、APC、p16、BRCA1、BRCA2、VHL、Krev-1P16基因慢性浅表性胃炎78.26%慢性萎缩性胃炎53.84%胃溃疡43.59%胃癌为13.89%

在肿瘤的形成过程中可分为几个阶段：①暴露于有关致癌物；②致癌物在体内的代谢活化；③致癌物与处于危险状态的细胞成分（尤其是DNA）间的相互作用—启动阶段；④DNA损伤修复、细胞死亡或存留以及异常的细胞克隆在组织中复制—转化阶段；⑤该异常克隆生长成可测量的癌前细胞灶—促进阶段；⑥肿瘤生长并扩散到身体的其它部位—发展阶段正常上皮增生上皮早期腺瘤中期腺瘤晚期腺瘤癌转移染色体：改变类型：基因：5q突变和丢失APC,MCC?12q突变K-ras18q丢失DCC?17q突变和丢失P53DNA损伤修复基因MSH和MLH1失活DNA甲基化改变其它基因改变(如TGF-b-II受体基因)结肠癌发生的基因改变模式图Vogelstein,1990（二）疾病易感性的测定

1、传染病慢性丙肝病人中，HLA-B44出现频率高达30%以上对白喉毒素敏感的基因定位在5号染色体长臂，而对脊髓灰质炎病毒敏感性基因定位在19号染色体长臂。2、非传染病参与亚硝胺代谢的细胞色素P450（CYPs）基因族中的CYP2E1启动子区RsaI识别的单核苷酸多态性与食管癌发病风险增高有关，携带c1等位基因者发生食管上皮癌前病变和食管癌的OR值分别为3.1和3.2

参与解毒作用的谷胱甘肽转硫酶（GSTs）的基因GSTM1，为+/+和0/+型与食管癌发病风险增高相关（OR=2.3），而且，GSTM1+/+和0/+基因型与CYP2E1c1/c1基因型联合可显著增加食管癌发病风险（OR=8.5）

（三）疾病防治措施的研究

1、传染病的预防

（1）新疫苗的研制—核酸疫苗（2）研究疫苗预防效果—与疫苗无应答的关系，如对乙肝疫苗低应答或无应答人群中，白种人和日本人携带HLA-DR3和HLA-DR7比率较高；而中国人HLA-DR14-DR52基因的携带率较高（3）疫苗株引起的感染

2、非传染病的防治异硫氰酸盐能组断环境致癌因素的活化，一些蔬菜特别是十字花科蔬菜富含异硫氰酸盐的前身物。如肺癌，当蔬菜摄入量从每天100g增加到500g时，肺癌的危险性约降低60%；作为抗氧剂的胡萝卜素可减少或防止DNA的损伤；叶酸可改变DNA甲基化或减少染色体断裂。

（四）疾病治疗效果和预后评价1、治疗效果评价从分子水平研究药物治疗过体内某些指标的变化情况2、疾病预后的评价胃癌病人nm23基因、P27KIPI基因、TGF-BRI基因表达与生存率的关系，结果发现，癌组织内上述基因高表达组手术后3年和5年生存率均高于低表达组或阴性组

五、生物标志与分子流行病学

生物标志（biologicalmarkers,biomarkers）是可以测量的、能代表生物结构和功能的大分子物质，如DNA、RNA或蛋白质等。

（一）暴露标志与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志，称为暴露标志

1、外暴露标志

外暴露标志主要指环境因素的暴露生物性因素：微生物、寄生虫、生物毒素等；非生物性的：某些化学和物理因素

2、内暴露标志

对于生物性病原因子而言，可以是病原因子本身或其代谢产物，也可以是与宿主体内生物分子结合的产物，如病毒整合基因、DNA加合物等；对于非生物性（如化学性）致病因子而言，内暴露标志可以是体内运转分子或代谢产物，也可以是与宿主靶细胞的结合物等，如暴露于苯并(a)芘后，在淋巴细胞中能检测到特异的DNA加合物。

（二）易感性标志宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志，称为易感性标志，如宿主的遗传特征、营养、免疫、机体的活动状态等。

如apoE有三种异构体为E2、E3、E4，研究表明90%的III型高血脂症患者的apoE表现型为E2/2纯合子，而在正常人群中E2/2纯合子仅为1%-2%（三）效应标志

宿主暴露于某种因素后产生结构或功能性变化的生物性标志，称为效应标志或疾病标志，如突变的基因、畸变的染色体、特异抗体、细胞因子等

六、分子流行病学应用的主要研究方法

（一）检测基因表达的实验方法

1、核酸杂交技术：Northern杂交、斑点杂交、原位杂交等。2．PCR技术：RT-PCR、原位PCR、半定量和定量PCR

3．Western杂交（二）检测基因结构变化的实验方法1．Southern杂交2．PCR技术：PCR-SSCP、随机引物多态性PCR，差异显示PCR、限制性长度多态性PCR3．核苷酸序列分析

4．Western杂交

检测方法

①实用性②可信性③有效性灵敏度、特异度第二节研究内容常用的生物标志传染病生物标志

表16-1传染病研究常用的生物标志类别生物标志意义病原体核酸病毒和细菌DNA、RNA,质粒DNA、噬菌体DNA、转座子DNA，病原体基因多态性等病原体特征研究，病原体分类、检定，传染源、传播途径确定，耐药检测及机制研究，人群感染状况等病原体蛋白病原体特异蛋白（包括酶蛋白）结构、表达量及功能活性同上病原体抗原蛋白抗原，多糖抗原，脂类抗原病原体分类、检定，传染源、传播途径确定，人群感染状况等人体血清抗体血清IgG、IgM等人群感染状况、免疫水平，疫苗接种效果评价等人体基因组基因结构、表达、调控，基因多态性机体易感性第二节研究内容慢性非传染病的生物标志

表16-2慢性非传染性疾病常用的生物标志类别生物标志意义核酸类基因组、癌基因、抗癌基因、修复基因、酶代谢基因结构、功能及多态性，mRNA；病原体DNA、RNA等疾病诊断及分布，疾病易感性、环境危险因素研究，健康状态评价，人类学研究等蛋白类蛋白质结构、表达量及功能活性疾病诊断及分布，疾病易感性、环境危险因素研究，健康状态评价等酶类酶的结构、表达量及功能活性同上抗原抗体类疾病特异抗原、抗体疾病诊断及分布，疾病易感性，环境危险因素研究等其他类糖类、脂类、激素类、多胺类、细胞因子类等疾病诊断及分布，病因研究，疾病易感性，健康状态评价第二节研究内容二、暴露测量外暴露研究第二节研究内容检测鉴定生物性病原因子流感嗜血杆菌研究病原生物进化变异规律o157大肠杆菌确定传播途径S.munchen菌感染测量非生物性因素暴露吸烟烟雾

内暴露研究传染性疾病①人体感染状况②追踪传染源慢性非传染病①内暴露水平②生物作用水平第二节研究内容三、效应测量第二节研究内容传染病

慢性非传染病

健康状态

免疫效应病理性效应基因表达和代谢异常基因突变或染色体畸变第二节研究内容四、易感性测量遗传性疾病

Huntington病应用分子流行病学方法很快确定了HD基因紧密连锁遗传位点D4S10及其DNA标志慢性非传染病

载脂蛋白E(apoE)不同基因型在动脉粥样硬化和冠心病发病中易感性不同传染病

不同基因特征的人群对HIV的易感性差异很大传染病预防接种效果评价预防接种相关疾病研究慢性非传染病第二节研究内容五、疾病防治效果评价潜隐期长多影响因素

第三节研究方法测量指标与标本采集现场调查研究方法实验室检测技术研究设计

一、测量指标与标本采集

测量指标的选择生物标本选择的一般原则测量指标：暴露指标、效应指标、易感性指标标本采集

生物标本库(biologicalspecimenbank,BSB)第三节研究方法描述性研究病例对照研究病例病例研究队列研究巢式病例对照研究实验性研究第三节研究方法二、现场调查研究方法三、实验室检测技术核酸技术核酸凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis)

脉冲电泳(pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE)聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)核酸杂交(nuclearacidhybridization)核酸测序(DNAsequencing)第三节研究方法

蛋白质技术

凝胶电泳、蛋白转印杂交酶学技术

免疫组化、多位点酶电泳技术生物芯片技术

基因芯片其他检测技术实验中的质量控制第三节研究方法四、研究设计设计研究目的和路线第三节研究方法表16-3生物标志的研究路线及意义研究路线研究生物标志研究目的和意义1EEMIEM外暴露与内暴露的关系，确定暴露标志的有效性2EEMBAM外暴露对生物作用标志的影响，确定暴露标志的有效性3EEMEBEM外暴露对早期生物效应的影响，确定暴露的生物效应4EEMASFM外暴露对结构和功能改变的影响，探讨暴露的致病性5EEMPM外暴露对病理标志的影响，探讨暴露的致病性6EEMCDM外暴露对临床疾病标志的影响，探讨暴露的致病性7EEMHCM外暴露对健康状态的影响，探讨暴露的健康效应8IEMBAM内暴露与生物作用标志的关系，确定内暴露标志的有效性9IEMEBEM内暴露对早期生物效应的影响，确定内暴露标志的有效性10IEMASFM内暴露对结构和功能改变的影响，探讨暴露的致病性…IEM…余类推，似研究路线5、6、7…BAMEBEM生物作用标志与早期生物效应的关系，探讨暴露效应真实性…BAMASFM生物作用标志与结构和功能变异的关系…BAM…余类推，似研究路线5、6、7…EBEMASFM确定早期生物效应的致病意义…EBEM…余类推，似研究路线5、6、7…ASFMPM探讨ASFM的病理意义及早期诊断价值…ASFM…余类推，似研究路线6、7…Mexp+MsusEBEM,ASFM,PM,CDM,HCM探讨不同暴露和易感性因素与效应结局的关系第三节研究方法

设计要点

①研究目的创新性、实用性、可行性

②测量指标

结局指标、暴露指标、易感性指标③测量方法

用成熟的方法④调查方法与样本样本有代表性