二细菌的生长繁殖消毒与灭菌

细

菌

感

染

的

检测试验二细菌的生长繁殖、消毒与灭菌一、探讨：1、消毒灭菌的方法、试验室生物平安2、细菌的人工培育：培育基、细菌培育技术、细菌生长现象二、示教：1、消毒灭菌的常用方法2、药敏试验3、培育基制备、种类、用途4、细菌生长现象视察三、操作：细菌的接种（液体、半固体、固体培育基）(一）消毒灭菌方法、试验室生物平安1.常用术语消毒(disinfection)：利用理化因素杀死物体或环境中病原微生物的措施。并不确定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物灭菌(sterilization)：利用理化因素杀死物体上全部微生物的过程，包括芽胞。无菌操作（aseptictechnique)：防止细菌进入人体或其他物品的操作技术。（2）常用方法物理消毒灭菌法：

热力灭菌法：干热灭菌法、湿热灭菌法辐射杀菌法：电离辐射--X、β、γ射线非电离辐射--紫外线、日光、微波滤过除菌法：滤过除菌法干燥低温抑菌法：抑菌和灭菌化学消毒灭菌法：生物消毒灭菌法热力灭菌法干热灭菌焚烧、烧灼、红外线干烤（160~170℃/2h）热力灭菌法湿热灭菌巴氏消毒法：62℃30min或72℃30sec煮沸法30min流淌蒸气消毒法间歇蒸气灭菌法高压蒸气灭菌法：121℃,1.05Kg/cm2(15个大气压),20min辐射杀菌法①电离辐射：X、β、γ射线原理:通过产生OH－、O2等活性游离基进行杀菌；通过破坏DNA的结构导致菌体死亡②非电离辐射：紫外线、微波、超声波、日光辐射杀菌法：非电离辐射ⅰ.紫外线：200～300nm日光(最佳：265～266nm)原理：导致DNA分子构型变更DNA复制出现差错用途：只用于空气和物品表面的消毒（留意防护）ⅱ.微波：细菌体内的蛋白质、核酸等分子在微波场下高速旋转、振动，细菌蛋白质凝固、核酸变性而死亡。常用于对非金属器械的消毒，优点是无污染而且快速。ⅲ.超声波是指频率大于20kHz的声波，其频率高，波长短，定向性好，穿透力强。原理：空化作用用途：液体或可放置液体中不影响其性能的物品滤过除菌法贝克菲滤器蔡氏滤器玻璃滤器膜滤器孔径0.22um-0.45um除菌空气过滤器:无菌棉花、活性炭及细玻璃纤维等可对空气进行过滤除菌2、化学消毒灭菌法常用消毒剂(disinfectants)的杀菌机制使菌体蛋白变性或凝固干扰微生物酶系统和影响其代谢损伤细胞壁、细胞膜环氧乙烷消毒设备医学上常用消毒剂类型作用机制及种类类别作用机制常用种类酚类蛋白变性，细胞膜损伤石炭酸醇类蛋白变性乙醇氧化剂氧化、蛋白沉淀高锰酸钾、过氧乙酸、碘酒重金属盐氧化、蛋白酶变性红汞、硫柳汞表面活性剂蛋白变性，细胞膜损伤新洁而灭染料干扰氧化、抑制繁殖龙胆紫酸碱类破坏膜、壁，蛋白凝固醋酸、生石灰烷化剂蛋白质、核酸烷基化环氧乙烷醛类与氨基结合,蛋白变性甲醛、戊二醛化学消毒灭菌法高效消毒剂high-level中效消毒剂intermediate-level低效消毒剂

low-level可杀死包括细菌芽胞在内所有微生物不能杀死芽胞，可杀死细菌繁殖体、真菌、大多数病毒可杀死大多数细菌繁殖体，对真菌、病毒杀灭力弱1.含氯消毒剂2.过氧化物消毒剂3.醛类消毒剂4.环氧乙烷1.含碘消毒剂2.醇类消毒剂1.季铵盐类2.氯已定3.高锰酸钾医疗器械物品的消毒灭菌高危器械物品需进入无菌组织的物品。全部这些物品都应当灭菌。中危器械物品不进入无菌组织但接触黏膜的器械。接受消毒即可。低危器械物品只接触未损伤皮肤但不进入无菌组织和不接触黏膜的物品。一般用后清洗、消毒即可。快速周转的医疗器械室内空气消毒灭菌a.物理消毒法紫外线照射（1.5W/m3，1h）最常用；滤过除菌：空气通过孔径小于0.2μm的高效过滤装置以除去细菌和带菌尘埃b．化学消毒法包括化学消毒剂喷雾和熏蒸过氧乙酸喷雾、熏蒸；过氧化氢喷雾；二氧化氯溶液喷洒；中草药点燃烟熏手和皮肤的消毒用肥皂和流淌水常常并正确洗手病原微生物污染时应用消毒剂消毒消毒灭菌的方法热力灭菌法辐射杀菌法滤过除菌法干燥与低温抑菌法干热灭菌法湿热灭菌法物理消毒灭菌法化学消毒灭菌法高效消毒剂中效消毒剂低效消毒剂3、试验室生物平安生物平安（biosafety）是生物技术平安的简称狭义的指现代生物技术的探讨、开发、应用及转基因生物可能对生物多样性、生态环境和人类健康产生潜在的危害。广义的指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康及生态环境所产生的危害或潜在风险。（1）生物平安的内容转基因生物、外来入侵物种、环境污染病原微生物（感染性疾病、人畜共患疾病、动物疾病、食源性疾病、医院感染）试验室泄漏：生物武器、生物恐怖遗传资源疼惜合成生物技术转基因及其它新型生物技术事故引发的生物危害

是由进行病原体探讨、教学、诊断、治疗、生物制品研发和生产等机构的事故导致病原体泄漏，引发了传染病暴发的生物灾难。这类生物灾难往往影响较大，危害范围小，造成局部灾难大，持续短1979年，苏联国防微生物与病毒探讨所炭疽芽孢干粉制剂车间的加压系统爆炸，约10公斤芽孢粉剂泄漏，造成斯维尔德洛夫斯克城数百人伤亡。2003年9月新加坡国立卫生探讨院BSL－3试验室发生探讨人员感染SRAS病毒的事故。2003年12月我国台湾省一试验室也发生了探讨人员感染SRAS病毒的事故，2004年4月我国国家CDC的专业试验室发生了SARS的试验室人员感染。（2）如何实现试验室生物平安？加强管理，规范行为，消退隐患，确保平安如何管？依法、规范管理管那些？病原微生物、试验室设立、风险评估、试验活动、试验装备、废弃物、人员类别根据传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，第一类能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。第二类能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。第三类能够引起人或动物疾病，但一般情况下对人、动物或环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物第四类在通常情况下不会引起人或动物疾病的微生物。如小鼠白血病病毒等病原微生物分类管理病原微生物试验室的分级管理（二）细菌的人工培育：培育基的概念、种类、用途细菌培育技术细菌生长现象1.培育基的概念、种类、用途、制备培育基（culturemedium):是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖运用的混合养分物制品。基础培育基增菌培育基选择培育基鉴别培育基厌氧培育基依据物理性状：液体、固态、半固体依据用途牛肉膏3.0g

蛋白胨10.0g

氯化氯化钠（NaCL）5.0g

磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g

琼脂15.0g

蒸馏水1000mL

混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，112kPa高压灭菌15min，冷却至45℃倾注灭菌平板。一般琼脂平板制备2.细菌的培育方法分别培育：划线接种在固体培育基的表面，因划线的分散作用，使很多原混杂的细菌在固体培育基表面上散开。纯培育：挑取一个菌落，移种到另一培育基中，可生长出来的大量的纯种细菌。发酵培育：在适宜的条件下，发酵罐中大量培育微生物（细菌、真菌等）细胞和生产代谢产物的工艺过程。分别培育：纯培养(pureculture)液体培养基斜面培养基菌落(colony)纯培育：菌种筛选摇瓶试验发酵罐中试验发酵培育—由试验室探讨到产业化的过程发酵生产3.培育基中生长现象：液体培育基菌膜生长

沉淀生长

混浊生长

混浊：大多数细菌沉淀：链状生长的细菌菌膜：专性需氧菌，如结核杆菌、枯草杆菌。

有鞭毛的细菌：试管中沿穿刺线呈羽毛状或云雾状混浊生长；平皿中迁徙样生长无鞭毛细菌：沿穿刺线线状生长或无扩散生长现象用于细菌的动力试验无动力有动力迁徙生长3.培育基中生长现象：半固体培育基菌落colony：在固体培育基上，一般经18～24小时培育后，单个细菌即可繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团。不同细菌菌落在大小、形态、颜色、气味、透亮度、表面光滑/粗糙、潮湿/干燥、边缘整齐、溶血性不同3.培育基中生长现象：固体培育基细菌的菌落一般可分为三种：光滑型菌落(smoothcolony，S型菌落）：新分别的细菌大多呈光滑型菌落，表面光滑、潮湿、边缘整齐。粗糙型菌落(roughcolony，R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。黏液型菌落（mucoidcolony，M型菌落）：菌落黏稠、有光泽，似水珠样。细菌多有厚荚膜或丰富粘液层。粗糙型菌落黏液型菌落光滑型菌落水溶性色素（如铜绿假单胞菌）脂溶性色素（如金黄色葡萄球菌）铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌4.人工培育细菌的用途医学感染性疾病的病原学诊断细菌学探讨生物制品的制备工农业生产基因工程中应用二、示教：1、消毒灭菌的常用方法:物理--热力（干、湿热各两个）过滤器（3-4种）、冰箱、紫外线（两个）、超生波化学--高、中、低效消毒剂各类型2-3个代表；2、药敏试验：纸片法3、培育基的种类：见前说明、视察实物4、细菌生长现象视察：见前、视察实物药敏试验：纸片法ZoneInterpretiveCriteria(mm)DrugDiskcontent(ug)ResIntSusccefazolin301415-1718gentamicin101213-1415三、操作：细菌的接种培育液体培育基固体斜面培育基半固体培育基固体平皿培育基1.固体平皿培育基分别接种方法右手执笔式握持接种环，在酒精灯火焰上烧灼接种环，待冷，取待测菌液一环。左手抓握琼脂培育基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种。持接种环在琼脂表面的1区涂布，划线时接种环与琼脂表面呈30°～40°的角度轻轻接触，利用腕力，切忌划破琼脂表面。烧灼接种环，待冷后，将接种环在2区、3区划线数次，各线条间隔要小，但不能重叠。划完3区不需烧灼接种环，在4区作连续划线，如此反复至划完整个平皿（如图3）。图1接种环的握持方法图2平皿的握持方法1区4区3区2区图3划线分离的方法左：分区右：培养后的结果接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将平皿的底朝上，放置在37℃孵箱内孵育24h。取出后视察琼脂表面的菌落分布状况，留意视察最终1～2区内是否分别出单个菌落，并视察记录菌落特征（如菌落大小、形态、透亮度、色素等状况）。2.固体斜面培育基接种方法3.半固体培育基接种方法右手持接种针，灭菌冷却以