第六章、放射免疫分析

第六章体外分析技术

体外分析技术是一组超微量体外分析技术的总称，它是利用某种特异性结合剂与被测物和标记物进行结合反应，从而对极微量物质进行定量分析的分析技术。1960年Berson和Yalow首次应用放射免疫分析法（RIA）测定胰岛素，开创了生物活性物质微量测定的新时代，是微量分析方法学上的一大突破。本章主要以RIA为例介绍这类方法的基本原理及方法特点。第一节放射免疫分析

一、基本原理：放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类技术，其基本原理为竞争性抑制。即：放射性标记抗原和非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）共同与特异性抗体发生可逆性结合，如图8-1。这种竞争可用以下反应式来表达：

Ag+Ab→AgAb

+

Ag*

↓

Ag*Ab

式中Ag*代表标记抗原，Ag代表非标记抗原，Ab代表特异性抗体，Ag*Ab代表标记抗原抗体复合物，AgAb代表非标记抗原抗体复合物。

当反应体系中同时存在Ag、Ag*和Ab，而Ag*的量一定、Ab的量限定（分子数少于抗原）时，随着Ag的增加，Ag*Ab的量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈负相关竞争性抑制。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原抗体复合物的结合率（B/T、B/F、B/B0）为纵坐标，绘制剂量效应曲线（calibrationcurve），也称标准曲线。

试剂盒组成：（以T4测定为例）1、Ag(系列标准品)，浓度分别为：0、20、40、80、160、320ng/ml2、Ag*，125I-T4（红色，作为示踪剂）3、Ab，抗T4抗体（作为结合剂）4、分离剂（免疫分离剂，结合反应达到平衡后将结合部分与游离部分分开）

0204080160320待1待2加样：1、Ag（系列标准品及待测样品）50ul/每管2、Ag*200ul/每管3、Ab100ul/每管混匀，37℃45分钟，加分离剂离心，测定结合部分放射性。放射免疫分析的几种标准曲线图：

抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律，即：

当反应达到平衡时，k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。设KA为平衡结合常数，也称亲和常数，则有：

k1和k2分别代表结合速度常数和解离速度常数，[Ag]、[Ab]、[AgAb]分别代表游离抗原、游离抗体和抗原抗体复合物的浓度。假设Ab0和Ag0分别代表抗原、抗体的初始浓度，B和F分别代表反应平衡时结合和游离抗原的%，（以分数表示，B+F=1），可以推导出B的函数式，由上式可看出是以B为函数的一元二次方程。对每一特定的RIA系统，[Ab0]和KA是固定的，[*Ag0]也是固定的，所以B在直角坐标上随非标记[Ag0]呈双曲线走向。二、基本试剂（一）、抗体（antibody）(1)、抗体的制备：抗体是体外放射分析中应用最广的结合剂，是用纯化的免疫原免疫动物制备而得，免疫的成败在于免疫原和动物种类以及注射途径、佐剂的使用、注射剂量和时间等。

分子量超过5000的蛋白多肽物质具有较好的免疫原性，容易刺激高活度的抗体形成。分子量小于5000的肽类物质免疫原性低，需要与载体蛋白结合方能引起明显的抗体形成。应该指出，动物对抗原的免疫反应个体差异很大，当一批动物用同样的免疫原和免疫程序进行免疫时，往往只有部分动物产生满意的反应。（2）抗血清（antiserum）的质量鉴定：评价结合剂的主要指标有滴度、特异性和亲和力。

1）滴度测定：测定方法是将抗血清稀释成不同浓度，分别加入一定量的标记抗原，在适当的反应条件下达到平衡后，分离B与F，计算不同稀释度的抗血清与标记抗原的结合百分率，以结合百分率为纵坐标，以抗血清稀释度为横坐标，绘制抗血清稀释曲线（如图）。

选择结合率为50%时所对应的稀释度，作为该结合剂的稀释度，该稀释度即为滴度。抗体滴度越高表明抗体的质量越好。

2）特异性测定：抗血清的特异性是指抗体与待测物以外的结构类似物结合的程度（又称交叉反应率）。

交叉反应百分率=[Y]50/[Z]50×100%其中[Y]50为被测物结合率50%时的浓度值；[Z]50为结构类似物结合率50%时的浓度值。干扰轻者特异性高。3）亲和力和亲和常数测定：亲和力表示特定的抗原、抗体之间的结合能力，常用亲和常数KA来表示。KA越大，表示抗原、抗体之间结合能力越强，B/F值大，方法的灵敏度高。随着单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）技术的发展，提高了现代体外分析技术的特异性和亲和力。

（二）、放射性标记物

放射性标记物是体外放射分析的测量依据，常用的标记核素有125I和3H。对标记物的质量要求包括：（1）比活度（specificactivity）：体外放射分析法的定量范围一般在10-9-10-12mol水平，标记物的用量应等于或小于被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。高比活度的标记物是确保分析方法灵敏度的前提。

（2）放化纯度（radiochemicalpurity）：一般要求标记物的放化纯度在95%以上，若放射性杂质过多，标准曲线的斜率降低，将会影响测定的灵敏度。（3）免疫活性（immuneactivity）：标记物在标记和储存等过程中会造成损伤，使标记抗原的免疫活性下降，与抗体发生反应的能力减弱，甚至丧失，因此抗原活性的检测十分重要。要求标记抗原与待测抗原具有相同的免疫活性。（4）稳定性（stability）：

稳定性是指标记抗原在合理储存的条件下，保持其全部性能不变的程度。许多因素可影响其性能的稳定性，如标记方法、标记位置、置换水平、理化环境等都可使放射性核素从标记抗原的分子上脱落下来，或造成标记分子聚合或解离，使放化纯度明显下降。当标记方法合理，保存条件完善时，货架期可达1-3月。

（三）、标准品（calibrationstandard）

标准品是样品定量的基础，它的质和量的变化会直接影响样品的测定值。对标准品的要求包括：（1）标准品与待测物质应属同一物质；（2）在与结合剂发生反应时，应与待测配体有相等的活性和亲和力；（3）高度纯化，不含影响分析的杂质；（4）标准品的定量一定要准确。四、分离技术

在放免分析中，当抗原、抗体反应达到平衡后，必须将B与F分离，分别测定其放射性。理想的分离技术应兼备以下几点：（1）将B与F尽可能完全分离，并且不改变最初的平衡状态；（2）B与F的分离不易受血浆或血清等外界因素的干扰；（3）分离试剂廉价易得，操作简便、分离迅速、重复性好。几种常用的分离技术介绍如下：（一）沉淀法（precipitationmethod）

也称PEG法。溶解于水中的蛋白质，其分子周围有水化层，以此保持蛋白质在水中的稳定性，蛋白质分子吸水能力的大小取决于蛋白质分子电荷的多少。

在一般RIA中，反应体系PH值多为中性附近，接近蛋白质的等电点，γ球蛋白所带的电荷很少，形成水化层的能力较弱，当加入适当浓度的聚乙二醇或碱金属中性盐如硫酸胺等夺取其周围的水分子，使它失去水化层，从而将抗体γ球蛋白（B）沉淀下来，与游离部分的抗原分离。这种分离方法的优点是操作简便，分离迅速，价格低廉，但是，这种方法易受环境温度（温度高于30℃时沉淀物容易复溶）、pH值、离子强度和蛋白质含量(最终浓度达250mg/ml以上)及分子量(蛋白质分子量越大，用以沉淀的PEG浓度越小)的影响，并且有些抗原也可能被同时沉淀下来，所以，非特异性结合高。（二）双抗体法（doubleantibodymethod）

在RIA中，当抗原、抗体反应达到平衡后，由于抗原抗体复合物的浓度很低，而且处于可溶性状态，不能直接通过离心的方法加以分离。于反应体系中加入第二抗体，形成抗原-第一抗体-第二抗体复合物，通过离心将B与F分离开来。双抗体法为一种特异性的分离方法，非特异性结合低，但主要缺点是分离时间长，第二抗体用量多等。AgAb1Ab2Ag·Ab1Ab1·Ab2Ag·Ab1·Ab2（三）双抗体-PEG法（doubleantibody-PEGmethod）

这种方法是目前被广泛采用的一种方法，它兼顾了双抗体法和PEG法各自的优点，克服了双抗法分离时间长和沉淀法非特异性结合高的缺点，并且使第二抗体和PEG的用量大为减少，在常温加入分离剂后，无需温育，直接离心，可获得满意的结果。（四）吸附分离法（adsorptiveseparationmethod）应用经过特殊处理的吸附剂，将游离的小分子抗原或半抗原吸附，经过离心，随着吸附剂的沉淀，将F沉淀下来，而抗原-抗体复合物分子大，不被吸附，仍保留在溶液中，从而将B与F分离开。常用的吸附剂有葡聚糖包被的活性炭（DCC），离子交换树脂等。

（五）固相分离法这种分离法是将抗原或抗体通过特殊技术联结在固相载体上，免疫反应在固相载体上完成，达到平衡后形成固相的抗原-抗体复合物，可与游离部分分离。固相分离技术的方法较多，比如，试管固相法：将抗体IgG直接包被于试管底部，使用时将非标记抗原和标记抗原加入试管，抗原与包被在管底的抗体结合达到平衡後，弃去上清（F），洗涤后测定反应管（B）的放射性即可。固相分离技术的主要优点是操作简便、迅速，分离效果好，非特异性结合低，是一种比较有前途的分离方法。

（六）磁化分离技术（magnetizingseparationtechnique）磁化分离法是将磁化材料引入RIA体系，当反应达到平衡后，借助磁力将B与F分离，从而省去了离心的步骤。（七）微孔滤膜法（milliporefiltermethod）微孔滤膜法通常采用醋酸纤维素滤膜或玻璃纤维素滤膜，在放免反应达到平衡后，将反应液加入装有微孔滤膜的滤器上，抗原抗体复合物保留在滤膜上，游离部分被滤掉。

五、数据处理（标准曲线拟合）

RIA的数据处理是以标准品的检测结果为依据，拟合出标准曲线，再通过标准曲线求出待测样品的浓度值，标准曲线是衡量样品的客观尺度。标准曲线的拟合方式要慎重选择，使它能够真实的反应测量的结果，减少人为因素的引入。目前常用的方式为数学模型法。1、Logit-Log模型

Logit-Log转换是使双曲线直线化的最常用方法。它是将标准品浓度转换成Log浓度，作为横坐标，而把B转换成LigitB，LigitB=LogBx/（B0-Bx）。其中B0是0剂量结合率，Bx是任何剂量为X时的结合率（如图）：

可以看出，这是一条随剂量增加而下降的直线。这种方法的缺点是：由于剂量取对数，0剂量在拟合时不用，所以灵敏度有损失；如果反应系统不是理想模式，用本方法处理将有较大偏差。2、四参数Logistic模型四参数Logistic模型是国际原子能机构（IAEA）和世界卫生组织（WHO）推荐的数据处理模型，是对Logit-Log模型的发展。其通式为：

其中X是抗原剂量，Y是结合%，a、b、c、d为四个参数。对RIA来说，a可取实验所得的最大结合率B0，b可取同一批数据用Logit-Log法作线性回归所得的斜率，c可取使B0下降一半所需抗原浓度ED50，d可取实验所得NSB。四参数Logistic模型的图形如图：

3、其他拟合模型

如四参数单位点作用模型的稳定性较好，个别标准管出现坏点对拟合结果的影响较小；还有二次多项式拟合法、折线拟合法等。应当指出，不论采用何种数学模型进行曲线拟合，实验的结果应该是相同的或相近的，都不能改善实验过程低劣所带来的影响。

六、RIA的分析误差和质量控制

RIA是一类高灵敏度的超微量分析技术，易受各种因素的影响而使检测结果失真。因此，质量控制体系应包括生产及使用两个重要环节。作为生产厂家，应建立严格的质量检测程序，以保证进入市场的产品都符合质量要求，这是首要环节。作为用户则应建立严格的质量控制体系，以保证检测的质量。根据不同的目的，质量控制体系可分为实验室内部质量控制和实验室间质量评价。

（一）误差的来源按误差发生的统计学性质可将其分为：1、系统误差（systematicerror）

这种误差常表现为检测结果呈倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的因素导致的。（1）方法误差，如标准品稀释体积不正确；（2）仪器和试剂误差，如仪器状态不佳；量器不准；（3）操作误差，如不正确的操作习惯等。系统误差是可以通过努力消除的。

2、随机误差（randomerror）

这种误差是由偶然因素所引起，误差的出现是随机的，与真值的偏差是双向的。常见的原因如加样误差，由分离剂或离心机造成的错分误差等。（二）实验室内部质量控制（internalqualitycontrol）实验室内部质量控制侧重对检测质量的控制，它保证从收集样本开始到发出报告为止的全过程中，能及时发现检测过程中出现的各种误差，分析产生的原因，找出纠正的办法，以确保检测的质量。常用的评价指标有精密度、准确度、特异性、灵敏度、稳定性、有效性。1、精密度（precision）

精密度是指在相同的条件下，对某一样品多次检测所得结果的符合程度，即重复性。RIA系统的精密度是首先和随时应考虑的，是最重要的质量参数。评价方法如下：（1）、标准误差（SD）和变异系数2、准确度（accuracy）

准确度是指测定值与真值的符合程度。考核符合程度的实践往往需要多份测定的结果进行计算。准确度、精密度之间的关系：1．准确度、精密度均好。2．准确度较好，精密度差。3．准确度差，精密度好。4．准确度、精密度均差。

实验室内常用回收实验，健全性试验，“零”水平测定等评价方法的准确度。附回收率（recoveryrate）的测定：（1）回收率：回收率是反应测定值偏差的质控指标，测定方法是设回收管和对照管，对照管中加入待测样品，回收管中加入待测样品和已知量的分析物，经过测定全过程，比较已知量和测得量之间的一致程度，理论上回收率一般为90%-110%之间，回收率的计算方法：

（2）：回收率:在实际工作中常常用更简便的方法来计算回收率。回收率=测定值/质控管真值×100%（3）质控样品的应用：

1）质量控制样品（qualitycontrolsample）为了更加准确的对样本进行定量，我们使用质量控制样品，它是含有一种或几种测定物（其量值是经过标定的靶值），用来比较和评价测定系统的偏差和重复性的实验用血清。2）对质控样品的要求：

A、质控样品中的分析物应与待测样品具有相同的生物学活性和免疫原性，其他组成成分也尽量相同。B、质控样品中分析物的浓度应是准确定量的，并且应有一个合理的浓度范围，一般根据患者和正常人血清中被测物的浓度，制定高、中、低三个剂量水平，高者应小于标准曲线的最大剂量点，中者应为标准曲线的中间剂量点，低者应大于标准曲线的最小剂量点，这样能更好得发现整个检测范围内出现的变化，准确判断误差的性质和大小。C、在合理贮存的条件下，能长时间保存而不影响其性能，以便监控测定系统的远期重现性。D、质控样品的管数约为总样品管数的平方根，使用时将其分置于待测样本的不同位置。

3、灵敏度（sensitivity）灵敏度是指刚能与零标准管的测定结果在统计学上区别开来的最低浓度，即用该方法的最小可测值。计算方法是累积多批（一般为10次）测量结果，计算出零标准管的结合率为x-2SD时对应的剂量值，即为灵敏度。由此可见，灵敏度和精密度有一定的关系，当精密度好时，零标准管的结合率较高，对应的浓度值较小，最小可测值较小，即灵敏度较高。4、稳定性（stability）

稳定性是指测定试剂在合理保存和正确使用的条件下。在规定的有效期内，保持其全部性能不变。常用指标有：（1）零标准结合率：是指在没有未标记配体存在下，由标记配体与结合剂之间产生的最大结合率，理论上不应低于33%，这个指标主要用来反应结合剂的质量，它在整个有效期内应保持稳定。（2）非特异性结合率：它是指在没有结合剂的存在下，标记配体被分离试剂结合造成的结合率，由于检测过程中的种种原因，非特异性结合总会或多或少地存在，一般应控制在5%以下。

5、特异性（specificity）：

特异性是指该反应体系不受干扰物质影响的程度，反映的是对分析物测定的专一程度。交叉反应率越小，反应体系对分析物测定的专一性越好。

6、有效性（affectivity）：

有效性主要是指临床诊断符合率及临床使用评价。检测结果能有效地实现实验目的，应有可信的正常值及正常范围，在正常和异常之间应有良好的分离，以便得出结论，如有些要作有或无、阳性或阴性的回答，有些要确定浓度的高低等。应该指出，上面提到的各种质控指标，对于全面评价检测系统的质量及检测者的操作水平虽然是必要的，然而在实验室常规检测工作中，要完成如此众多的质控指标是不可能的，也是没有必要的。通常可根据实际需要和实验室条件，选择数项质控指标用于批内质量控制和批间质量控制。（三）实验室外部质量评价（externalqualitycontrol）

实验室外部质量评价是对各实验室之间的测定结果按统一的评价方案及方法比较分析，发现误差，找出原因，提出改进办法，以提高各实验室之间所得结果的可信性和可比性。外部质量评价要在做好内部质量控制的基础上才能进行。通常是根据工作需要，由一个负责单位来领导，提出计划及要求，提供实施外部质量评价用的统一样品，分发至各参加单位进行检测，然后将所得结果反馈给负责单位进行整理分析，对各有关单位的检测质量进行评价，促进检测质量的提高和资料的可比性。第二节免疫放射分析

免疫放射分析是利用过量放射标记抗体来测定样品中的抗原或半抗原。所用的标记抗体是过量的，抗原全部是非标记的，所以反应系统是非竞争性的全量反应。为了与放射免疫分析法相区别，它的创始人Miles一开始就将其命名为免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）并一直沿用到现在。

一、基本原理

放射性核素标记在抗体上，然后以过量标记抗体与抗原结合，多余的抗体通过一定手段除去，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原的量呈正相关。由于不存在竞争反应，其灵敏度明显高于RIA。如下式表式：IRMA中要分离的是游离抗体和复合物，都是大分子，一般分离方法难以奏效，目前主要靠单克隆抗体作分离剂。也就是每一IRMA系统至少要有两个抗体，一个起分离作用，一个起测量作用。所以，一个IRMA方法的建立，至少需要两个抗原决定簇，对很多小分子半抗原不适用。

（一）IRMA同样遵循质量作用定律

IRMA的函数式也是双曲线，若以B为纵坐标，它们是随抗原量增加而上升的曲线。（二）、IRMA的测量范围宽抗体含量越大，则欲达到饱和时所需要的抗原更多，这说明测量范围宽。但标记抗体过高，游离抗体的量也增多，分离时将有明显的分离误差，使NSB升高，低浓度抗原的测量精密度降低。所以标记抗体的最佳浓度应通过实验来选择。（三）、IRMA和RIA的主要区别：二、IRMA分类

（一）、双抗体夹心法（doubleantibodysandwichmethod）

此法采用固相抗体来代替经典的固相抗原的IRMA法，固相抗体先与待测物（或标准品）结合，再与标记的另一抗体反应，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，未结合抗体留在上清液中被弃去，测固相放射性。如下式表示：上式中的Ab1、*Ab2分别作为抗原上二个抗原决定簇的单抗，SP表示固相。（二）、标记双抗法（labeleddoubleantibodymethod）

标记抗体即为夹心法中那个标记抗体的抗体，亦即双抗，这样设计是为了简化标记每一特异性抗体，只要标记这个双抗体，即可作为通用示踪剂，例如用125I标记了兔抗鼠的IgG，则所有应用非固相的鼠抗体作为第二抗体的，均可用此标记的抗抗体作为示踪剂，如下式表示：

（三）、双标记抗体法（doublelabeledantibodymethod））

有些结构复杂的抗原有3个或更多个抗原决定簇，为此，可以用两个标记抗体进行IRMA分析，以提高复合物的放射性比活度，从而提高方法灵敏度和精密度。最后形成的标记复合物见下图：

三、数据处理

采用计算机数学模型的方法进行处理，常用的数学模型包括：三参数单位点质量定律数学模型、五参数Logistic模型、线性内插模型等。四、免疫放射分析的特点

（一）示踪剂

IRMA法中的示踪剂为标记抗体，是一种IgG蛋白分子，含有多个酪氨酸或组氨酸残基，易被放射性碘化，目前示踪剂的标记多用固相氧化剂碘化法，如Iodogen法等，很少影响其免疫活性，标记率可达70%左右。

（二）反应动力学质量作用定律认为反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中标记抗体是过量的，且反应是非竞争性的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIA法快，一般反应2-3小时即达平衡，当天出结果。（三）灵敏度

IRMA的灵敏度比RIA有明显的提高，约为10-100倍，这在某些分析项目中具有重要意义。如甲状腺功能主要指标有三项，即FT3、FT4的放免测定和TSH的IRMA测定，IRMA测定TSH能可靠的区分正常人和甲亢病人血清TSH含量的差别，只要TSH低于正常，FT3或FT4任一项高于正常即可诊断为甲亢，在复杂情况下，TRH试验时TSH高于正常，应否定甲亢。

（四）标准曲线的工作范围

当选择的标记抗体质和量适当，IRMA的工作范围宽。一般情况下，待测物含量低者不必浓缩，高者不必稀释，给临床检测带来方便，也避免了由于浓缩和稀释带来的误差。（五）特异性IRMA应用的固相抗体和标记抗体是分别针对抗原的两个抗原决定簇的单抗，不易发生交叉反应，因此特异性高。

（六）方法的稳健性在免疫反应中，有些抗原抗体间的亲和常数KA有明显的温度依赖性，降低温度有利于KA值的提高，有利于增加灵敏度。根据质量作用定律，当抗体的浓度大于1/KA，KA的影响就明显减少。IRMA中Ab0总是过量的，温度对KA的影响较小，一般在4-37℃的温度改变对实验结果无明显影响，所以IRMA常采用37℃温育，反应平衡时间明显缩短。方法的稳健性好。

（七）IRMA的主要缺点IRMA对蛋白和多肽抗原的检测是优越的。但它的典型的两位点夹心法需要二个抗原决定簇的抗原，这就大大地限制了对短肽及其它半抗原活性物的检测。

第三节其它的非放射性标记免疫分析法

在体外分析方法中，除了放射免疫分析和免疫放射分析外，还包括其它非放射性核素标记的免疫分析。如酶标记免疫分析，化学发光免疫测定，稀土元素标记的免疫分析法等。它们与前者一样，都是利用抗原与抗体的结合具有高度特异性这一重要特性，而不同之处只是利用的标记示踪物不同，因而其标记物的测定方法也不同。它们除了与前者同样具有高度特异性及敏感性外，还克服了放射性核素可能造成的环境污染，保存期短等缺点，因此得到了广泛的应用。一、酶标记免疫分析法

酶标记免疫分析法（enzymeimmunoassay，EIA）是以酶代替放射性核素标记抗体或抗原作为主要试剂的免疫测定法。它是将抗原抗体结合的高度特异性与酶促反应的高度敏感性有机的结合起来，用酶标记抗体（抗原），检测待测标本中的未知抗原（抗体），当相应的抗原抗体特异性结合后，加入相应的酶的底物，酶可以高效专一催化和分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的有无和深浅，可以判断待测标本中有无特异性抗原（抗体）以及量的多少。本实验是一种敏感、特异、简便，只需一般光谱分析仪器的微量测定技术。二、化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析法（chemiluminescence‘simmunoassay，CLIA），是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪剂，将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高度特异的抗原抗体反应结合起来的一种超微量的分析法。其特点是：设备简单，试剂稳定，无放射性污染，自动化程度高。

三、稀土元素标记的免疫分析法

稀土元素即镧系元素，其中有铕（Eu）、钛（Tb）、钐（Sm）、和镝（Dy）四种元素能发射离子荧光，这些稀土元素的螯合物，可以与抗原抗体结合，所以又称镧系荧光免疫分析。此螯合剂上的稀土元素在紫外光的激发下，可产生持续一定时间，一定光峰的荧光。而其它非特异性荧光寿命很短，待其衰减后，测量镧系元素的特异性荧光，可以完全排除背景荧光的干扰，此法又称时间分辨荧光免疫分析（time-resolvedfluoimmunoassay，TrFIA）。

本法操作方便，灵敏度高，特异性强，无放射性，标记物稳定性好，制备简单并可长期保存，加之曲线剂量宽，自动化程度高（分析系统类似放免法）等优点，深受生物医学工作者的高度重视，目前国外生产的TRFIA试剂盒包括甲状腺激素、类固醇激素，病毒性肝炎标记物、肿瘤相关抗原、蛋白质类、药物、多肽类和蛋白质类激素等，它们在基础医药学和临床医学各领域的应用，必将推动生物学检测技术的进一步发展，成为新一代标记免疫分析技术中的一支生力军。四、其它免疫分析法

其它免疫分析法如半抗原标记的免疫分析法，免疫PCR技术等。

常用放免、免放检测项目及临床意义项目名称主要临床意义促甲状腺素TSH甲亢、亚甲亢甲状腺素T4甲功和甲亢的辅助诊断三碘甲状腺原氨酸T3甲功和甲亢的特异诊断促甲状腺素释放激素TRH甲低的鉴别诊断胰岛素INS糖尿病的分类，胰岛素瘤鉴别诊断前列腺特异性抗原PSA前列腺疾病诊断C-肽C-P糖尿病分型及用药指导癌胚抗原CEA消化系统肿瘤等诊断及治疗监测甲胎蛋白AFP原性性肝癌，先天性畸胎，肿瘤五项之一血清铁蛋白SF缺铁性贫血肝、胰、肺、胆管恶性肿瘤，恶性淋巴瘤，多发性骨髓瘤，肿瘤五项之一糖类抗原CA50消化道、子宫前列腺膀胱等甲状腺球蛋白TG甲亢诊、治监测，甲状腺肿瘤鉴别诊断等甲状腺线粒体抗体TM-Ab慢性淋巴甲状腺炎（桥本氏病与其他甲状腺肿瘤鉴别诊断）甲状腺球蛋白抗体TG-Ab同上游离甲状腺素FT4甲低、甲亢游离三碘甲状腺原氨酸FT3甲亢、甲低血浆醛固酮Ald原发、继发醛固酮增多症，减少症等诊断β-绒毛膜促性腺激素β-HCG早期妊娠、异常妊娠、葡萄胎、绒癌等诊断促黄体生成素LH卵巢性闭经、垂体及下丘脑闭经的鉴别诊断，计划生育人胎盘泌乳素HPL了解胎盘功能，预测胎儿状况，滋养层细胞肿瘤、乳癌、卵巢癌等辅助诊断促卵泡成熟素FSH同LH垂体泌乳素PRL下丘脑垂体病变，柯兴氏综合症，未分化支气管癌雌二醇E2异常妊娠，卵巢疾患等雌三醇E3妊娠监测，胎儿