第八章色层分离

第八章

色层分离色层分离亦称为色谱分离(ChromatographicResolution,CR)或层析分离，在分析检测中则常称作为色谱分析(ChromatographicAnalysis,CA)。

它是一种物理的分离方法。当多组分混合物随流动相流经固定相时，由于各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的速度随流动相移动，使之分离。色层分离系统固定相流动相1903年俄国植物学家茨维特用菊根粉研究植物色素的提取物，以石油醚作洗脱剂，得到分离的黄色、绿色区带，故称为色谱分离法。1931年又有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了本法具有极高的分辩率。20世纪50年代：出现了气相色谱。20世纪60年代：发展了高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)。20世纪80年代：开始在生物工业中应用，主要应用于高附加值产品，如胰鸟素、干扰素、生长激素、白细胞介素-2等。有两次诺贝尔化学奖是授予色谱学领域的研究工作：1948年瑞典科学家Tiselins由于他的关于电泳和吸附分析的研究获奖；1952年英国的Martin和Synge因为发展了分配色谱而获奖。8.1色层分离基本概念8.2色层分离的基本原理8.3柱色层分离法8.4径向色谱8.5亲和色谱8.1色层分离基本概念8.1.1色层分离的特点8.1.2色层分离的分类8.1.3生物工业中的色层分离（1）分离效率高

色谱分离的效率是所有分离纯化技术中最高的，每米柱长的理论塔板数可达几千至几十万块塔板数。如葡聚糖凝胶颗粒直径为50~150μm，若每个理论塔板的高度相当于固定相两个颗粒的距离，则每米柱长的理论塔板数为3,333~10,000块。这种高效的分离尤其适合于极复杂混合物的分离，由于效率高，通常使用的色谱柱长一般只有几厘米至几十厘米。

8.1.1色层分离的特点（2）应用范围广——适合于各种原理从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质、以及热稳定到热不稳定的化合物，都可用色谱方法分离。（3）操作参数多——选择性强不同的固定相和流动相状态，固定相可用液、固两大类，流动相可用气体、液体或超临界流体；不同的洗脱方法，如前沿分析、置换展开、洗脱展开等；不同的操作条件，如温度、pH、离子强度和流动相速率等。

（4）高灵敏度的在线检测——可保证在要求的纯度下得到最高的产率。（5）快速分离

高效细颗粒层析剂和高压液相色层分离技术的采用，保证了在高分离效率前提下的高分离速率。（6）过程自动化操作——计算机的应用使色谱分离过程自动化。

包括自动进样、分离后的样品馏份自动收集、未达到要求纯度的馏份的再循环分离等。8.1.2色层分离的分类8.1.2.1按分离机理不同分类

（1）吸附色谱(AdsorptionChromatography,AC)指混合物随流动相通过固定相时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。吸附作用可以是物理吸附作用，也可以是化学吸附作用，如范德华力、静电力、共价结合力及氢键作用等。

吸附色谱包括无机基质吸附色谱（含多种作用力）、疏水作用色谱（疏水键）、金属螯合作用色谱、共价作用色谱、聚酰胺色谱（氢键作用力）等。（2）分配色谱(DistributionChromatography,DC)

又称为液-液色谱，流动相和固定相是两种互不相溶的液体，其中固定相是由液体涂渍到载体上形成的。分离原理是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱又可分为正相色谱和反相色谱。正相色谱的固定相为极性，流动相为非极性；反相色谱则固定相为非极性，流动相为极性。（3）离子交换色谱（IonExchangeChromatography,IEC）

基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。离子交换色谱亦可归类于吸附色谱。离子交换色谱包括多种分离原理：离子交换、吸附、吸收、穿透、扩散、离子亲和力等。（4）凝胶色谱(GelChromatography,GC)

亦称凝胶过滤，根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱(MolecularSieveChromatography,MSC)、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（SizeExclusionChromatography,SEC）。

凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起首先流出；较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的速率较慢；更小的分子能进入全部凝胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。分子大小进入凝胶颗粒内部孔隙状况下移通道下移速度流出顺序很小分子可进入全部孔隙最大最慢最后大分子不能进入所有的孔隙最小（仅颗粒间空隙）最快最先中等分子可进入较大的孔隙中等中等中等（5）亲和色谱(AffinityChromatography,AFC)

系利用生物分子间所具有的专一亲和力而分离。把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则当含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。在实际操作中，不同的分离机理常可能同时存在。例如：在硅胶薄层色谱中，同时包含吸附作用和分配作用；在生物大分子的离子交换色谱分离中，有时会包含离子交换作用、吸附作用、分子筛作用和生物亲和作用等机理。离子交换作用和亲和作用亦可看作是特殊的吸附作用，因而也可把离子交换色谱和亲和色谱归类于吸附色谱。由此看来，上述分类仅具有相对意义。

8.1.2.2按固定相形状不同分类（1）柱色谱分离各种不同机理的色谱分离都可在柱中进行。柱色谱分离具有进样量大和回收容易等优点。除用于分析外，还广泛用于生物样品的制备和工业生物产品的分离与纯化。用作分析时，其分辨率不如纸上色谱和薄层色谱高。

（2）纸上色谱分离——以滤纸为载体的分配色谱

固定相——水相，滤纸纤维一般能吸附25~29%的水份。流动相——各种有机溶剂。纸上色谱分离具有设备简单、操作方便、分离效率高、所需样品量少等优点，被广泛用于定性与定量分析。但由于分离量少和回收困难，因而一般不用于制备和生产。（3）薄层色谱分离——将固定相在玻璃平板上铺成薄层而进行分离的一种分离技术。

薄层色谱是柱色谱和纸上色谱二者的结合，兼有二者的优点，如操作简便、分离效率高、分离速率快和适合于不同分离机理的色谱分离等。薄层色谱分离法主要用于分析，如果增加薄层厚度（2~3mm），也可用于小量样品的制备。

8.1.2.3其他分类方法

（1）根据流动相的物态不同，可分为气相色谱分离、液相色谱分离和超临界色谱分离。

（2）根据操作压力不同，可分为低压色谱分离（<0.5MPa）、中压色谱分离(0.5~5MPa)和高压色谱分离(5~50MPa)。（3）根据洗脱操作时展开方式的不同，可分为洗脱展开法、前沿分析法和置换展开法三种。

8.1.3生物工业中的色层分离8.1.3.1色谱分离的规模（1）色谱分析：<10mg（2）半制备（或称中等规模制备）：10～50mg（3）制备（或称样品制备）：0.1～10g（4）工业生产：>20g/day8.1.3.2色谱分离方法的选择

选择依据（1）目的产物的分子结构、物理化学特性、及分子量的大小；（2）主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相近的杂质的成份与含量；

（3）目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。

常用方法：（1）对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子产品——多糖基质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等）离子交换色谱、疏水作用色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。（2）氨基酸、有机酸、核苷酸等小分子离子型化合物——离子交换色谱分离。（3）抗生素、生物碱、萜类、色素等次生代谢产物——吸附色谱、反相分配色谱分离。

8.1.3.3分析色谱与工业(制备)色谱的比较

（1）应用色谱技术范围的不同

分析色谱：流动相包括气相和液相，固定相形状包括柱、纸和薄板；制备和工业色谱：主要是以液相为流动相的柱上色谱。（2）操作上的不同

分析色谱：进样量愈小愈好，检测灵敏度越高越佳，大多用毛细管色谱柱；制备和工业色谱：进样量愈多愈好，色谱柱较大，径向色谱柱径达20cm以上，以可分离和纯化较多的产品。（3）色谱分离理论上的不同

理论塔板数与分离效果：对于生物大分子，色谱分离往往是多种分离机理的综合效果，有时分离的好坏与理论塔板数无明显的关系。分配系数的不同：*在分析分配色谱中，在一定温度下，分配系数为常数，也即溶质在两相中的关系成线性关系，称为线性色谱。*在制备和工业色谱中，样品的浓度较高，分配系数既是温度的函数，同时也是流动相溶质浓度的函数，称为非线性色谱。

样品保留值与峰高的不同

*分析色谱：同一样品的保留值是一个常数，因而可根据保留值的大小定性；色谱峰高与组分浓度呈线性关系，因而峰高可作为定量分析的指标。*制备和工业色谱：保留值不仅随不同样品而变，而且随样品的浓度而变，因而不能根据保留值定性。基于同样的原因，色谱的峰高也不能作为制备和工业色谱定量分析的指标。8.2色层分离的基本原理8.2.1分配色谱

8.2.2吸附色谱（包括离子交换色谱和亲和色谱）8.2.3凝胶色谱8.2.1分配色谱分配色谱是利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得以分离，其过程相当于连续性的溶剂萃取。适合于分配色谱的主要理论有：分配定律、阻滞因素（Rf值）、塔板理论等。8.2.1.1分配定律当一个被分离的混合物在流动相的携带下通过固定相时，溶质在固定相和流动相之间的平衡关系服从分配定律：

*当溶质浓度较低时，在一定温度下Kd为常数，溶质在两相之间的分配成线性关系，其色谱过程称为线性色谱；*当溶质浓度较高时，Kd=f(Cm),与溶质浓度有关，溶质在两相之间的分配成非线性关系，其色谱过程称为非线性色谱。

8.2.1.2阻滞因数（Rf值）Rf值为柱中颗粒空隙率和分配系数的函数：Rf值的范围为：0≤Rf≤1（1）当Kd=0时，Rf=1，此种溶质不溶于固定相，随流动相以同样的速率移动；（2）当Kd→∞时，Rf=0，此种溶质不溶于流动相，而被分配在固定相中；（3）对于0<Rf<1的溶质，Rf值越大，溶质随流动相移动的速率就越大，溶质被洗脱的速率也就越快。

8.2.1.3塔板理论

同蒸馏操作一样，色谱柱的分离效率也可用塔板理论来描述。所谓理论塔板高度是指这样一段柱高，自这段柱中流出的液体（流动相）和其中固定相的平均浓度相平衡（一般为两颗粒的距离）。

对于足够柱长，第i块塔板上溶质的分数为：式中N为色谱柱的理论塔板数，E为分离因素。fi(i)为一正态分布曲线，当i=NE/(E+1)时，该塔板上的溶质浓度最大，其最大值为：

随着洗脱剂（溶剂）用量的增多，N值就越大，展开的时间就越长，其高峰浓度逐渐减少，色带逐渐扩大。8.2.2吸附色谱

(离子交换色谱、亲和色谱)8.2.2.1等温曲线

吸附等温曲线是指在一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。有许多不同的等温曲线表达式，其中应用最广的是Langmuir（兰米尔）公式：（1）当溶质浓度很低时，c值很小，1+bc≈1。于是：此时，吸附色谱同分配色谱一样，均为线性色谱，常数a即为分配系数Kd（2）当溶质浓度很高时，c值很大，1+bc≈bc。

于是：

此时，吸附剂上的所有溶质结合位子都被溶质所占满，固定相中溶质的浓度达最大值mt。

8.2.2.2解离常数与分离因数

在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附方程式来表示：

A+BA-Bkakdmcq令：c—溶质在流动相中的浓度（即B的浓度）

q—溶质在固定相中的浓度（即A-B的浓度）mt—吸附柱可结合溶质分子的有效位子总浓度

m—吸附柱中空余的有效结合位子浓度ct—溶质总浓度（游离的+被吸附的）

溶质分子与吸附剂之间相互作用的解离常数为：

分离因数——指某一瞬间被吸附的溶质量占总量的分数，即：经整理可得：

A+BA-Bkakdmcq≤1

（1）较高的有效结合位子浓度、较低的溶质浓度和解离常数，具有较大的分离因数。

mt↑→α↑,ct↑→α↓，KP↑→α↓（2）当溶质分子浓度ct相对于有效结合位子浓度mt很低时，即mt>>ct时，有：

此时，α与ct无关。（3）分离因数的范围为0≤α≤1，当α=0时，此种溶质不与固定相产生吸附作用，随流动相以同样的速率移动；当α=1时，该种溶质分子都被吸附在固定相上，且不随流动相往下移动。（4）在柱色谱分离中，有效的分离通常要求α值至少为0.8。对于亲和层析剂，有效结合位子的总浓度mt在0.01mmol/L左右，若要使α值达到0.8以上，则Kp值应少于0.0025mmol/L。离子交换层析剂的mt值一般可达1mmol/L以上，其相应的Kp值应少于0.25mmol/L。（5）在柱色谱操作中，当流动相的体积达柱体积的1/（1-α）倍时，目的物质将从柱的末端流出。由此可知，若目的物质的分离因素α=0.8，色谱分离过程中希望目的物质留在柱内，则流动相体积与柱体积之比应少于5。

8.2.3凝胶色谱凝胶色谱分离具有许多特点：①凝胶为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子发生任何作用，蛋白质收率高，重现性好；②应用范围广，可分离从几百到数百万分子量的分子；③设备简单，易于操作，周期短；④层析剂不需再生即可反复使用，有的可连续使用几百次至上千次。

凝胶色谱柱的总体积分为三部分：

Vo—凝胶颗粒之间空隙的总体积（即外水体积）

Vi—凝胶颗粒内部空隙总体积（即内水体积）

Vm—凝胶颗粒基质本身所占体积。

洗脱容积——使溶质从柱中流出时所通过的流动相体积：即：或式中，Kd为分配常数，表示某溶质分子可以进入凝胶颗粒内部空隙的分数。

（1）关于分配常数Kd当Kd=1时，意味着溶质分子可以自由进入所有凝胶颗粒的微孔中，在洗脱过程中将最后流出色谱柱外；当Kd=0时，意味着溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外，而最先被洗脱。而对于中等分子，只有部分凝胶的空间能进入，其分配系数为0<Kd<1。其Kd值的大小就决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。在实际操作中，有时Kd>1，这表明除了凝胶的分子筛效应外，可能还存在吸附作用。（2）洗脱容积差设有两种溶质，其分配系数分别为Kd1和Kd2，两者的洗脱容积差为：可见，欲将两溶质分子完全分离，试样的体积应小于ΔVe。8.3柱色层分离法制备和工业规模的色谱分离大多采用柱色谱分离法，而纸上色谱和薄层色谱主要用于分析。吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子交换色谱和亲和色谱等都可在柱中进行。8.3.1层析剂8.3.2层析柱8.3.3洗脱操作8.3.1层析剂用于色谱分离技术中的固定相或分离介质，总称为层析剂。

基质：化学惰性物质，与目的产物和杂质都无结合作用；活性功能团：则根据所用色谱分离方法选用或者制取。

层析剂应具有的特性：（1）不溶于流动相，且具有较好的化学稳定性和机械强度。（2）具有较大的表面积和孔隙度，且粒度、孔径分布均匀。（3）有较高的回收率和负载量。（4）具有较好的热稳定性。（5）无毒性，分离过程不引起目的产物的变性或失活。常用层析剂：无机基质层析剂：硅胶、氧化铝、活性炭、多孔玻璃、磷酸钙等。有机基质层析剂：琼脂糖、葡聚糖、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇等。8.3.2层析柱一般情况下，柱的分离效率与柱长成正比，和柱的直径成反比，因此色谱柱通常是细长的，一般地L/D=20～30。柱直径大多为2～15cm。设计柱长时需考虑下列几点：（1）柱的最小长度取决于所要达到的分离程度，目的产物的分离程度高，分辨率低，需要较长的色谱柱。（2）较大的柱直径需要较长色谱柱。（3）柱越长，L/D比值越大，就越难得到均匀的填装。就目前采用的匀浆填装技术，填装长度一般不能超过50cm。

8.3.3洗脱操作（展开操作）加入洗脱剂而使样品中各组分分离的操作称为展开。展开操作的方式有多种，在实际使用中选择何种操作方式主要取决于：（1）样品的性质；（2）所需产品的纯度：（3）要求的产率。下面将介绍几种常用的展开方式。

8.3.3.1前沿分析法

——前沿分析法中，样品连续不断地输入色谱柱，即样品溶液本身起流动相的作用。AA+BA+B+C0溶质总浓度流出液体积设混合液中，溶质A、B、C与固定相的作用力为：C>B>A开始时，溶质全部吸收在固定相内，流出液为纯溶剂；经一段时间洗脱后，与固定相作用力最弱的A物质首先被洗出，出现第一个阶梯；随后作用力较强的B物质和更强的C物质也先后流出，形成第二个、第三个阶梯，直至稳定不变。前沿分析的特点（1）前沿分析法只能得到其中作用力最弱的纯物质，因而一般不用于混合物的分离。（2）适合于在产品的精制中除去痕量杂质。（3）分离过程中样品溶液本身就是流动相，其流出液中的组分浓度不变。AA+BA+B+C0溶质总浓度流出液体积采用前沿分析法可测定样品的吸附等温曲线

设样品溶液中只含有一种溶质组分。开始时，溶质被固定相所吸附，从柱中流出不含溶质的纯溶剂，此段时间所流出的纯溶剂量称为溶质的保留容积Vr。当溶质在固定相中达饱和状态后，不再吸附溶质，此时溶质开始流出，且浓度与进料一样。0溶质浓度流出液体积CVr由Vr可计算出柱中固定相所吸附的溶质浓度：

式中，c为样品溶液中（流动相）溶质的浓度，Vs为固定相的有效体积。在一定温度下，改变流动相溶质的浓度，测定其保留容积Vr，再计算出固定相所吸附的溶质浓度q，即可绘制吸附等温曲线。0溶质浓度流出液体积CVr8.3.3.2置换展开法置换展开法又名顶替法或取代法。样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂作为流动相，去替代结合在固定相表面的溶质分子。在置换展开法中，最先从柱中被置换出来的是作用力最弱的溶质，最后出来的是置换剂本身。0溶质浓度流出液体积AB置换剂置换展开法特点：（1）各组分的浓度在展开过程中不但不会降低，有时甚至还能提高，即起到浓缩作用。（2）固定相的利用率较高。（3）各组分一个连一个流出，界限不甚分明，因而分离并不理想。（4）合适的置换剂不易找到。0溶质浓度流出液体积AB置换剂8.3.3.3洗脱展开法

样品输入色谱柱后，随即加入一种不与固定相发生作用的溶剂或几种溶剂的混合物作为流动相冲洗。以流出液体积对溶质浓度作图，为由一系列的峰组成的曲线，每一个峰对应于一个组分，最先出现的峰是与固定相作用力最弱的溶质，以后顺次出现的峰其溶质与固定相的作用力顺次增加。0溶质浓度流出液体积AB洗脱展开法特点：（1）峰的面积与溶质含量成正比，由此可作定量分析。（2）组分的保留容积为开