生物催化剂发现

上节课内容复习生物催化定义：是利用生物催化剂(主要是酶或微生物)来改变(通常是加快)化学反应速度的作用。生物催化转化的分类：(1)发酵：用活细胞将原材料(如糖、淀粉或甲醇)转化成更复杂的目标产物。(2)前体发酵：发酵过程中添加前体物质，并由活细胞将其转化成目标产物。(3)生物转化：用酶或静息细胞经过一系列步骤，将前体转化成目标产物。(4)酶催化：提取粗酶或部分纯化的酶，将底物转化成目标产物。主底物辅助底物酶催化剂反应介质生物催化反应体系主产品副产物生产率选择率第二章生物催化剂的来源与筛选大纲2.1概述2.2微生物酶筛选的策略2.3微生物和酶的一般筛选方法2.4优良菌种选育2.5从基因组DNA筛选酶的方法2.1概述2.1.1生物催化剂的概念1.生物催化剂：是生物反应过程中起催化作用的游离或固定化酶的总称。

2.分类

结构形式细胞酶多细胞生物体游离型催化剂固定化催化剂2.1.2生物催化剂来源与多样性生境的概念生物已知种类估计总种类百分比病毒50001300004细菌47604000012古细菌5000.1-1真菌6900015000005藻类400006000067苔藓植物170002500068裸子植物750被子植物25000027000093原生动物30800100000312.1.3生物催化剂的寻找和发现提高筛选效率的基本原则①需要设计合适的用酶方法，使得目标反应非常清楚②需要在有希望的微生物中寻找具有合适活性的微生物③需要建立方便和敏感的分析系统尽可能多的搜寻微生物样本。2.2微生物酶筛选的策略2.2.1常规生物催化剂筛选的一般策略设计反应过程选择合适的酶或产酶微生物建立有效且方便的分析方法生物催化剂筛选的反应过程的设计图2-1海因酶和N-氨基甲酰氨基酸水解酶两步选择性水解制备D-对羟基苯基甘氨酸生物催化剂筛选的反应过程的设计例：①生物法：腈水合酶与酰胺酶催化反应生产丙烯酰胺CH2＝CH－COOHCH2＝CH－CN腈水合酶H2OCH2＝CH－CONH2H2O酰胺酶②传统法：铜催化丙烯腈的水合生产丙烯酰胺除去O2丙烯腈水水合作用浓缩除去Cu离子，脱色丙烯酰胺产物催化剂的回收制备催化剂的分离未反应的丙烯腈酶或产酶微生物的筛选一般产酶微生物筛选的原则①能够通过发酵在相对较短的时间内高产目标酶；②微生物应该尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶；③微生物所产生的酶最好有比较高的专一性④所采用的微生物应该是不产生有害物质的非致病性的安全微生物⑤微生物的遗传稳定性应该比较高生物催化剂筛选的主要途径

（1）从商品酶库中筛选

（2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选生物催化剂

（3）从自然界发现和筛选产酶微生物

（4）从基因库筛选丹麦的NovoNordisk公司和美国的"Genecor国际公司"两家。它们的销售额分别占世界酶制剂市场份额的44%和29%。英荷合资的皇家DSM-吉斯特公司近年来已迅速崛起并成为全球第3大酶制剂生产企业。该公司的酶制剂销售额约占世界酶制剂市场的15~19%。至于其它中小型酶制剂公司只能分享10%不到的酶制剂市场份额。从商品酶库中筛选英文简称

中文全称

所属单位

所在地

ACCC中国农业微生物菌种保藏管理中心

中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

北京

CCCAU中国农业大学菌种保藏中心

中国农业大学

北京

CCTCC中国典型培养物保藏中心

武汉大学

武汉

CCVCC中国普通病毒保藏管理中心

中国科学院武汉病毒研究所

武汉

CFCC中国林业微生物菌种保藏管理中心

中国林业科学院森林生态环境与保护研究所

北京

CGMCC中国普通微生物菌种保藏管理中心

中国科学院微生物研究所

北京

CICC中国工业微生物菌种保藏管理中心

中国食品发酵工业研究院

北京

CMCC中国医学微生物菌种保藏管理中心

中国药品生物制品检定所

北京

CMMC中国海洋微生物保藏中心

中国水产科学研究院黄海水产研究所

CPCC中国药用微生物菌种保藏管理中心

中国医学科学院医药生物技术研究所

北京

CVCC中国兽医微生物菌种保藏管理中心

中国兽医药品监察所

北京

MCCC中国海洋微生物菌种保藏管理中心

国家海洋局第三海洋研究所

厦门

SIIA四川抗菌素工业研究所

成都

从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选ATCC美国典型菌种收藏中心

AmericanTypeCultureCollectionUSAIFO

日本大阪发酵研究所InstituteforFermentationOsaka,JapanKCTC

KoreanCollectionforTypeCulturesKoreaFDA美国食品与药品管理局

FoodanddrugAdministrationUSANIHJ

NationalInstituteofHealthJapanNIH美国国立卫生研究院

NationalInstituteofHealthUSAVKM

RussianCollectionofMicroorganismsRussiaNRCA

NationalResearchCenterofAntibioticsRussiaNCTC

NationalCollectionofTypeCultureUnitedKingdomNCYC英国国家酵母菌种收藏中心

NationalCollectionofYeastCultureUnitedKingdom从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选建立有效和方便的筛选分析方法成功的选择方法是基于目标酶活而精心设计的。为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。从自然界发现和筛选产酶微生物初筛（一）目的：得到具有潜在应用价值的目的微生物。初筛

一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰，把少量有用的微生物筛选出来。（二）要求：快速——有预测或预见敏捷——迅速处理好众多的样品。经济——得到有广泛目标的有用微生物。二初筛（三）筛选方法琼脂平板培养基上培养生产出群体后初筛。1用PH指示剂检测有无有机酸或胺类。

中性麝香草酚蓝:PH＜6.0黄,PH＞7.6蓝,PH6.0~7.0绿2在培养基中加入碳酸钙检测有机酸。可在菌群周围形成清晰的碳酸钙溶解区。3在培养基中加入底物检测细胞外酶、酶抑制剂等特定的底物可以与细胞外酶形成显色反应；酶的反应对特定底物形成溶解或沉淀。复筛1微生物初筛鉴定2发酵培养基的选择3培养与发酵4抽提试验复筛培养与发酵（1）试管培养试管摇床培养。常用。目的：原种斜面培养后，为了提高初筛效率。（2）摇瓶培养（摇瓶发酵）250或500ml锥形瓶再200rpm摇床上培养。目的：培养基和培养条件的初筛。

培养与发酵（3）玻璃自控发酵罐容量5～50L。是摇床向发酵罐的过渡阶段。目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。（4）试验罐培养中间工业试验阶段目的：放大和验证摇床试验结果，积累发酵工艺规律和发酵参数。为工业规模生产打基础培养与发酵（5）发酵试验的三个阶段2.2.2从极端微生物中筛选极端酶的策略极端酶（extremozyme）是由极端微生物（extremophile）产生的酶，与之相对应的中间型是常态微生物（mesophilicorganism）产生的酶。如何进行极端酶的研究和开发①必须有足够的酶，这就涉及极端微生物的培养②依赖极端酶在中间宿主中的表达极端环境中的微生物极端环境：高等动植物不能生长，大多数微生物不能生活的高温、低温、强碱、强酸、高盐、高压、高辐射、等特殊环境。◆1种类：极端嗜热菌，最适生长温度90～105℃，高达110℃

极端嗜冷菌，可在零下70～80摄氏度度生长。

极端嗜盐菌，新疆盐湖中的可耐受20～30％的NaCl

极端嗜碱菌，PH9～10

极端嗜压菌，在深海底，生活压力7.1～8.1×107Pa◆3应用

开采石油：嗜压菌产气增压降低原油粘度。生产特殊酶制剂：嗜碱细菌产生的蛋白酶作为洗涤剂的添加剂

环境保护：嗜碱芽孢杆菌产生的木聚糖酶能够水解木聚糖产生木糖和寡聚糖，可用来处理人造纤维废物

遗传工程以及基因技术：从水生栖热菌中提取耐热的TaqDNA聚合酶◆2特性都为古细菌。具有不同于一般微生物底遗传机制、特殊底细胞结构和生理功能。表2-1某些有应用前景的超级嗜高温酶酶功能酶活力的最适温度/℃葡萄糖异构酶葡萄糖→果糖，生产高果糖糖浆95木聚糖酶木浆和纸生产中水解木聚糖105α-淀粉酶淀粉水解85~90纤维二糖水解酶纤维素水解105β-葡聚糖酶A，β-葡聚糖酶B纤维素水解95β-甘露聚糖酶甘露聚糖水解92α-半乳糖苷酶半乳甘露聚糖水解100~105β-葡萄糖苷酶纤维二糖水解105β-木糖苷酶木二糖水解未定β-半乳糖苷酶乳糖水解802.2.3未培养生物催化剂的发现策略未培养微生物（unculturedmicroorganism）美国微生物学家Colwell的实验室在1982年首先提出“不能培养微生物（nonculturablemicroorganism）”的概念，他们发现快速生长的霍乱弧菌和大肠杆菌移植到无营养料的盐水中，经长时期的低温保存后，细胞数不减，代谢活力不变，但在正常肉汤培养条件下不产生菌落，因此他们用“活的但不能培养（viablebutnonculturable,VBNC)”一语描述这种潜伏状态的细菌。

2.3微生物和酶的一般筛选方法2.3.1从自然界发现产酶微生物采样富集培养：是根据微生物的生理特点，在目的微生物含量较少时，设计一种选择型培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣种变成人工环境下的优势种。分为分批式（摇瓶培养）和恒化式（连续培养）两种不同的方式。分离筛选图2-2从自然界发现产酶微生物的方法2.3.2生物催化剂的高效筛选高通量筛选（high-throughscreening,HTS）是近年来发展起来的一种新型筛选技术，其特点是微量、快速、灵敏、准确，在短时间内可以检测大量的微生物。2.4优良菌种选育优良生产菌种应该具备的基本特点：①生产菌种应该具备在较短的发酵周期内产生大量发酵物②在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的反应产物或副产物，以便于分离纯化。③能利用多种来源的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性较小，可用价廉易得的原材料进行培养，以降低发酵成本。④对需要添加的前体物质（底物）有耐受力，并且不将底物、产物作为一般碳源利用。⑤具有抗杂菌污染，抗噬菌体感染的能力。⑥发酵泡沫少，利于提高装料系数、提高单罐产量、降低发酵成本⑦生长繁殖能力强