蛋白质折叠与细胞内的蛋白质折叠课件

第三章:蛋白质折叠第四章:细胞内的蛋白质折叠第三章:蛋白质折叠一、蛋白质复杂的三级结构信息贮存于氨基酸序列中关于氨基酸序列与蛋白质空间结构的关系研究，最早的工作是由C.Anfinsen(1960)关于核糖核酸酶的研究工作他研究了核糖核酸酶的去折叠和重折叠过程。该酶是由124个氨基酸组成的蛋白质有四对二硫键，其组合有105{[(24)!/244!]=105}种的可能方式。当用还原剂如b-巯基乙醇(HOCH2-CH2-SH)作用时二硫键被部分还原，继续加大b-巯基乙醇的量，二硫键可全部被还原。用8M的脲加b-巯基乙醇处理，多肽链分子内四对二硫键可全部被还原，肽链伸展为无规卷曲，酶活性完全丧失。但如果将脲和b-巯基乙醇透析掉并在空气中进行氧化，多肽链可又重新折叠为一个具有特定的三维结构和催化活性的酶，它与未经处理的酶具有相同的溶解度并可结晶并获得相同的X-射线衍射图，其吸收光谱也相同。这是一个很好的蛋白质一级结构序列决定其三维结构的例子即顺序决定构象二、关于蛋白质折叠的理论模型各种实验及理论计算均证明蛋白质的天然构象在热力学上是最稳定的1、框架模型(Frameworkmodel):P.S.Kim和R.L.Baldwin于1982年提出了蛋白质折叠的框架模型。该模型认为，在蛋白质折叠的过程中大约有15个氨基酸残基的多肽链首先折叠为瞬态的a螺旋或b片层结构的二级结构单元，然后这种瞬态的结构通过扩散彼此接近形成aaab或bb的复合结构而获得稳定这种复合结构，又称为折叠单元，折叠单元作为一个核心，吸引和稳定其它摆动着的二级结构单元形成折叠框架其它的侧链将适应这个框架。2疏水折叠模型(HydrophobicCollapseModel)和熔融球态模型(MoltenGlobuleModel):该模型提出折叠是由疏水折叠开始的。即四体石蜡的疏水片段首先聚集在一起，然后进一步聚集长大，形成一种称为熔融球蛋白中间体，此种结构是一种具有二级结构，但很少有三级相互作用的结构。疏水残基有很大一部分暴露在溶剂中。加热,酸或碱盐,破坏不牢固的次级键，使蛋白质功能丧失不可逆变性蛋白质的变性失活核糖核酸酶可逆的变性:恢复到正确的折叠结构恢复生物学的活性变性因素物理因素：加热、加压、超声波、紫外线化学因素：胍、脲、有机溶剂、强酸强碱、SDS

-巯基乙醇、

重金属离子生物碱试剂复性蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性,即可逆变性.四、蛋白质折叠的热力学五、蛋白质折叠的识别将一个新的顺序与一个已知的特征化的,三维结构花样的叠合识别在大多数情况下是比较成功的，在某些情况下是相当可靠的。尤其是当两个蛋白具有相同的重要氨基酸顺序时，它们总是在那些区域具有相同的三维结构。另一种折叠的识别方式即所谓的Threading。此方式主要是通过分析已知蛋白的由实验所测得的三维结构，来估计可允许的sub-in-del而非进行未知结构与其同源家族的多重对齐。即用已知蛋白质结构中的氨基酸类型的经验配对势的大小，来衡量取代的可能性。简言之，一个位置上可取代的容忍度，是通过某个位置上和其残基周围的所有位置上的氨基酸类型间的相互作用自由能来估计的第四章:细胞内的蛋白质折叠离体实验并不能精确地反映细胞内新生蛋白质的实际折叠过程.离体情况下蛋白质的去折叠后的再折叠(refolding)过程对蛋白质浓度及物理化学条件的要求完全不同于在细胞内所发生的情况

在离体情况下的再折叠实验往往涉及到整条肽链,而在活体情况下则是当新生肽段的N端在核糖体上一经合成或刚从细胞膜上移位,折叠活动就开始了。3）在细胞中许多蛋白质是以均一或不均一的寡体复合物就开始装配，而在离体的情况下当浓度如细胞内那么低时形成复合物的可能性极小一）二硫键异构酶(PDIase)PDIase是一种含有486个氨基酸残基亚基的真核均二聚体酶(homodimericeukaryoticenzyme)。它有催化二硫键的链间交换使多肽链间的二硫键达到正确配对的功能。奇妙的是PDIase还是具有a2β2异四配体脯氨酰羟化酶(heterotetramerprolylhydroxylase)的β亚基，该羟化酶可使胶原蛋白的脯氨酸残基羟化，其反应的重要性目前尚不清楚在真核细胞中，二硫键在蛋白质被输运到细胞表面之前在内质网中形成。在细胞内二硫键异构酶proteindisulfideisomerase,PDI可催化内二硫键的交换以防止形成不正确的二硫桥一）二硫键异构酶(PDIase)结构PDIisnowknowntocatalyzeallofthereactionsthatareinvolvedinnativedisulphidebondformation.Nativedisulphidebondformationisacomplexprocess.Disulphidebondsforming(oxidation)Incorrectbondsmustbebroken(reduction)orrearranged(isomerization).TheenzymePDIisamulti-domain,multi-functionalmemberofthethioredoxin(afamilyofsmallredoxactiveprotein)superfamily.PDIcancatalysethiol-disulphideoxidation,reductionandisomerization.Isomerizationoccursdirectlythroughintramoleculardisulphiderearrangementorthroughcyclesofreductionandoxidation.YeastPDIPDB:2B5EHumanPDIDomaina,a’,b,b’PDB:1ERTStructure

ofPDITianG.etalcell2006Structure&FunctionTheaanda’domainsbothadoptacanonicalthioredoxinfold;Thebandb’domainsbothdisplayminorvariationsfromthetypicalthioredoxinfold.Theinterfacebetweenthebandb’domainisextensivewithaburiedsurfaceareaof700Å2,andtheinterfacesbetweentheaandbdomainsandtheb’anda’domainsareonly200Å2.Theactivesitesintheaanda’domainspointateachother,butareseparatedbyalargeUshapecleft,andthedistancebetweenC61andC406is28Å.Thereareseveralhydrophobicpatchesofsurroundingtheactivesitesintheaanda’domainsandeachofthebandb’domainshaveonehydrophobicpatchatthesamerelativesites.Theprimarysubstratebindingsitehasbeenmappedtotheb’domainformammalianPDI.Thehydrophobicpatchonthebdomainextendsthesubstratebindingsiteoftheb’domaintoformalargersubstratebindingplatform,whichislocatedbetweenthetwoactivesitesintheaanda’domains.Structure&Function图4-1牛胰蛋白酶抑制剂的结构

在胞外的蛋白质折叠研究中二硫键的形成已被人们进行了较深入的研究三对二硫键分别被标以绿色，β链被标以蓝色，a螺旋被标以红色。该蛋白在完全还原状态是非折叠的，只有再被完全氧化形成二硫键后才能重折叠图4-2BPTI的折叠途径

BPTI的折叠途径：非折叠的蛋白在还原状态有六个半胱氨酸残基，主要的单二硫键中间体在残基30和51之间，有一对二硫键。此中间体进一步形成双二硫键中间体，此中间体含有非天然的二硫键，此中间体对天然二硫键中间体Cys30-Cys51和Cys5-Cys55的形成是主要的。一旦形成了这样的双二硫键中间体第三对天然二硫键Cys14-Cys38将会迅速形成图4-5(a)肽单位可接受反式(trans-)和顺式(cis-)两种不同的构象；(b)反式(trans-)和顺式(cis-)脯氨酸。

脯氨酰顺-反异构酶(PPIs)催化顺-和反-构象之间Xaa-Pro肽键的慢互变，因此可加速含有脯氨酸的多肽链的折叠促进脯氨酸残基顺式多肽键的形成Cyclophilin可催化顺和反脯氨酸的异构。Cyclophilin提高了脯氨酸肽的顺反异构化作用的速率，与非酶作用相比大约提高了一百万倍。虽然酶的作用的机理仍不清楚，但可以肯定的是它引起肽基团的变形和解聚Cyclophilin与一个含有脯氨酸的四肽的复合物的晶体结构已解析。图4-6Cyclophilin与一个含有脯氨酸的四肽复合物的结构为一个八股的反平行β桶（蓝色），两段a螺旋（红色）位于外部，与含有脯氨酸的四肽（绿色）结合的活性部位位于β桶的外部脯氨酸残基紧紧地结合在结合沟的疏水口袋中，并且羧基端氧原子与蛋白质的的碱性侧链形成氢键，肽片段与疏水环境的结合，通过减少肽基团的电荷分离而促进了顺反异构化作用，并产生了具有单键特征的肽键，同时与Cyclophilin的紧密疏水相互作用，可使肽基团的几何学上变形产生异构化作用这两种机理或它们的组合将减少绕肽键转动的能垒。此能量是顺反异构化所必需的三、分子伴侣(Chaperone)非折叠蛋白含有大量的暴露于溶剂的疏水区域，并因此有形成分子内和分子间聚集的倾向。分子伴侣就是一类具有阻止不正确的折叠或修正不正确折叠的蛋白质，尤其是对于多结构域蛋白和多亚基蛋白的不正确折叠分子伴侣起着极其重要的作用在细胞内分子伴侣并不催化二级结构的形成，而是在蛋白质知折叠的过程中，去识别和稳定部分折叠的中间物，使肽链进行装配和去装配。它们是通过与非折叠或聚集多肽的暴露于溶剂的疏水表面结合并逐步释放它们来达到此目的图4-7大肠杆菌PapD蛋白的晶体结构

PapD是一个促进毛发蛋白合适组装的分子伴侣，但不是它的组成部分。分子伴侣与毛发蛋白亚基C端的一个19肽的保守肽段的复合物的结构PapD蛋白由两个结构上相似的结构域组成。球状CPK模型表示的是毛发蛋白的保守多肽。该多肽与PapD蛋白的G1b链结合并显示伸展的构象。多肽链与蛋白之间以氢键连接，多肽链末端的羧基锚在PapD蛋白的两个结构域的接点的分叉上，并通过氢键与蛋白的不变残基Arg8(R8)和Lys112(K112)残基结合，PapD的突变研究表明这些残基的突变将使其丧失与毛发蛋白亚基结合的能力。G1b链的保守疏水残基以绿色表示。从图中我们可看到PapD蛋白有一个宽的裂缝，此裂缝含有几个保守的暴露于溶剂的疏水残基这些残基在功能上是专一性地与PapD的靶肽片断结合Chaperonesareaclassofproteinswhichbindtoincompletelyfoldedorassembledproteinsinordertoassisttheirfoldingorpreventthemfromaggregating.CrystalstructureofhumanHsp90-alpha.PDB:2h55Crystalstructureofthecarboxy-terminaldomainofhtpG,theE.coliHsp90PDB:1sf8CrystalStructureoftheMiddleDomainofHtpG,theE.coliHsp90PDB:2gq0CrystalStructureoftheN-terminalDomainofHtpG,theEscherichiacoliHsp90,BoundtoADPPDB:2IOR图4-9由14个亚基排列为两圈的柱形的分子伴侣GroEL分子的图解该家族蛋白由14个分子量为60KD的亚基组成，这14个亚基排列成并列的两个分别为7个亚基的环，每个环都有一个中心的腔该腔可容纳下一个分子量为90KD的球状蛋白，Hsp60蛋白与ATP结合并具有弱的ATP酶活性，起着稳定折叠中间物的作用。因此可以阻止错误折叠的发生和错误结构的形成，指导多肽链按正确的路线装配Hsp60蛋白

(a)GroEL的亚基结构(b)GroEL分子中四个亚基结构域排列的图示。近赤道结构域形成分子的中间部分，并且是两个七元环之间的参与反应的结构域。顶点结构域位于圆柱的顶端和底部，并形成一个开放的由顶部，贯串到底部的通道。小的连接结构域在七元环的中部形成圆柱壁的最薄的部分

根据电子显微镜三维重构图形建立的在两者不同的功能态情况下的GroEL分子的模型。GroEL的大的构象变化发生在GroES和ATP结合时，GroES分子结合在一个GroEL环上并关闭了中央空腔，这样GroEL环变大并且空腔内部的腔变得更宽GroES结合在GroEL的顶点结构域上关闭了GroEL的中央空腔。一旦GroES结合到GroEL分子的一个环上，GroES就发生了构象变化，这降低了对第二个GroEL环的亲和力，因此GroEL-GroES复合物的占优势的功能态是不对称的即GroES仅结合在GroEL圆柱的一端，显然GroEL分子的两半之间有很强的结构相关性GroES结合到一半的GroEL上将影响另一半的性质尽管两个GroES之间有大约150Å的距离GroES分子由七个亚基组成。每个亚基由97个氨基酸残基组成，七个亚基饶着一个七重轴，连接在一起与GroEL有相同的对称性GroES的晶体结构表明GroES的结构象一个园屋顶(dome)，它的直径大约为75Å高度为30Å并且在中央部分有一个小孔GroES的一个亚基的结构

亚基结构的核心是一个由两个β折叠片互相堆积在一起的反平行β折叠片组成的β桶，有两个大的环区域穿过此核心一个环区域伸展在环平面上，园屋顶的顶端覆盖了中央孔，另一个环区域富含疏水氨基酸残基伸展到园屋顶之下与GroEL的顶点结构域发生相互作用。此环区域在X-射线晶体学结构中是无序，的但核磁共振研究表明当GroES结合到GroEL上时此环变得有序。突变研究也表明此环区域上的疏水残基大约分子伴侣的功能是相当重要的(a)一个非折叠的蛋白质分子黄色结合到GroEL-ADP复合物红色的一端，GroES分子绿色结合到复合物的另一端。(b和c)GroES从反方向被释放然后与ATP一起重结合在GroEL的正向位置浅红色。(d)在中央腔中蛋白正在折叠或去折叠时发生ATP的水解。(e)GroES和蛋白质分子的释放需要ATP的结合和在反方向的水解。(f)新的未折叠的蛋白质分子重新结合到GroEL上有GroES正向位置结合的GroEL环受到很大的结构变化，形成宽的由顶点结构域和连接结构域内腔的壁形成的内腔，此腔部分地由GroES园屋顶的溶剂所封闭。另一个反向位置的环有一个小的对溶剂开放的腔，未折叠的蛋白可以结合在环的正向或反向的位置上但仅仅结合在正向位置上的那些分子能适当的折叠重排，在反向位置的多肽链的结合和释放似乎在功能上并不重要ATP-boundstatesofGroELcapturedbycryo-electronmicroscopySchematicDiagramofGroELFunctionalStates

(a)NonnativepolypeptidesubstratebindstoanopenGroELring.(b)ATPbindingtoGroELaltersitsconformation,weakensthebindingofsubstrate,andpermitsthebindingofGroEStotheATP-boundring.(c)ThesubstrateisreleasedfromitsbindingsitesandtrappedinsidethecavityformedbyGroESbinding.(d)Followingencapsulation,thesubstratefoldsinthecavityandATPishydrolysed.(e)AfterhydrolysisintheupperGroES-boundring,ATPandasecondnonnativepolypeptidebindtothelowerring,dischargingligandsfromtheupperringandinitiatingnewGroESbindingtothelowerring(f)toformanewfoldingactivecomplex