分子生物学常用仪器介绍课件

研究生实验技能培训

－－分子生物学实验常用仪器介绍实验中心Biometra梯度PCR仪工作原理多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环

Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……PCR仪的应用领域基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基因定点突变基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究（real-timePCR）/基因表达谱研究（DNAchip,SAGE）医学领域疾病基因检测/遗传病的产前诊断致病病原体的检测肿瘤治疗中癌基因的检测

会推广到大部分疾病治疗前的检测

DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证其他:

动、植物检疫（转基因动植物检测）

PCR仪器的变迁三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）电加热块＋自来水冷却（PE，1988）电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）温度梯度,荧光检测(如Roche的Lightcycler)风加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）PCR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量PCR仪，此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR仪，PCR仪的主要参数温度控制要精确度升降温的速度更快的升降温速度，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间，能提高PCR反应特异性。ABI早就有升降温速度高达5°Ceppendorf也推出了升降温速度可达到6℃/秒和4.5/秒梯度PCR仪

“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。原位PCR扩增

在PCR仪上增加原位PCR模块就可以在玻片上进行原位PCR扩增，多槽式高通量PCR仪

随着基因组高通量研究的需求的提高MJ有一种一拖四，就是1个主机带4个扩增槽，每个槽可以独立控温，一次可以作96x4个样品的PCR，不过一旦出现问题4个都不能用了。ABI则在原来的9700的基础上推出了双384孔的基座，一次完成384x2个样品，使得9700的功能又扩展到高通量领域而无需购买新的机器，可惜两个384槽不能独立控温。eppendorf则有一个控制面板，可以控制5个独立的PCR仪，每台机器可以联合，而且互不影响，但是比较浪费空间。

样品基座——PCR反应多在0.2或者0.5的管子中进行，多数PCR仪也配备了不同的可更换样品槽适配不同的样品管。eppendorf有一个有趣的设计，一个槽内带有0.2和0.5两种不同样品孔，不需更换基座就可以分别使用两种不同的反应管ABI的9700就可以更换不同的样品槽软件——新的PCR仪都比较注重程序编写的简易性。大屏幕，显示实时信息，倒计时，记忆存储多个程序、自动断电保护等都有助于实验室中的复杂环境使用。Biophotometer生物分光光度计Biophotometer

生物分光光度计使用常见问答

答：DNA的在Biophotometer上能测定的最高浓度并没有一个绝对的值，这是因为这个浓度跟使用的比色皿光程和样品的稀释比例有关的。Biophotometer测定的最大吸光度是3.0。当测定的DNA样品吸光度大于2.5时，建议采用2mm的比色皿光程替代10mm。10mm光程下测定的A260=2.5时，相当于125µg/ml浓度的双链DNA，1.25µg/ml的1:10稀释。如果是在2mm光程6.25µg/ml的1:10稀释。答：Biophotometer在260nm下能够测定的最小吸光度是0.05，这个吸光度值相当于浓度为2.5µg/ml的双链DNA的吸光度（约125ng双链DNA溶解在50µl溶液中），请确保核酸样品的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1。答：请检查以下操作中的细节是否有所注意：1－DNA样品的A260吸光度值是否>0.1。请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）2－待测样品是否经过了充分的混匀，这样才能保证测定值的均一3－待测样品中有相当含量的杂质。A260/A280和260/A230是DNA纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5下其比值应该在2.0或2.5，A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A280是蛋白质的吸光度答：产生四个加号的原因是因为测量的数值超过了测量上限>3.0A，请检查1－比色皿是否被完全压入比色皿槽内，出现加号有可能是比色皿的基座挡住了光线的通路。2－您使用的比色皿的中心高度是否在8.5mm？3－比色皿中是否加入了足够量的空白对照溶液？核酸与蛋白的电泳分析琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测分析电泳槽水平平板垂直平板垂直电泳系统凝胶浓度选择琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围电泳缓冲液

常用三种缓冲液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解核酸电泳的指示剂指示剂：溴酚兰二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色二甲苯青：水溶液呈兰色电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当载样缓冲液指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液作用：①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内②在电泳中形成肉眼可见的指

示带，可预测核酸电泳的速度和位置③使样品呈色，使加样操作更方便核酸电泳的染色剂最常用的染色剂溴化乙锭银染色蛋白电泳的染色剂最常用的染色剂考马斯亮蓝G考马斯亮蓝R溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收BIO-PROFIL凝胶成像分析系统主要用途琼脂糖电泳，聚丙烯酰胺电泳，DNA、RNA和蛋白质1D\2D电泳凝胶，SouthernNorthern和Western印迹膜；点杂交膜；薄层层析板、TCL放射自显影胶片、菌落等样品的图像采集和分析，可对核酸、蛋白质的凝胶电泳条带进行分子量大小及含量分析。基本组成密闭型机箱：

一体化全封闭暗箱，设计精巧；最大程度上避免紫外线对人体的伤害。紫外透射台：

紫外光源波长254/306/365nm，紫外透射面积20x25cm。白光板（可选）：

透射面积20x25cm

相机：

带积分功能高清晰黑白摄像头；高分辨率数码相机；高分辨率专业数字黑白CCD摄像头。

镜头：

电动/自动镜头。主要用途（1）图像获取图像获取容易可以以多种格式存储获取粘贴板上的图像、与其它软件交换图像资源图像复制功能，对所获取的原始图像进行剪切、复制

主要用途（2）图像处理彩色图像转换为黑白灰度图像图像的镜像和旋转图像反色、即负片效果图像的对比度／亮度调整图像的均匀化、平整区域、背景校正图像的锐化、柔化、羽化、强化物体边缘主要用途（3）图像分析条带定位：提取图象中的条带信息，确定泳道中是否有条带存在并定位分子量计算：在输入Mark泳道中各条带的已知分子量后，由计算机求出指定未知条带的分子量和bp值（碱基对数）。密度扫描：对指定泳道进行扫描，绘出扫描曲线，并计算出该泳道中各条带的密度积分和峰高背景去除：多种去背景的方法，并可对扫描曲线进行去背景后矫正离心机AvantiJ-301高速冷冻离心机主要附件：8*50ml角转（Max30000rpm）10*100ml角转（Max18000rpm）6*38.5ml水平转头（Max24000rpm）冷冻超速离心机主要附件：10*2ml角转（Max130000rpm）8*8ml角转（Max80000rpm）工作原理离心机:利用惯性离心力分离液态非均相混合物的机械。根据分离方式可分为：过滤式分离式沉降式。若被处理的物料为悬浮液就称为离心沉降；若被处理的物料为乳浊液称为离心分离。

主要用途主要用于各种生物大分子的分离、纯化、浓缩（如对病毒、生物大分子、高聚化合物沉降等）同时还可进行相对分子量的测定等。转子固定角转子水平转子离心力公式：G(xg)=11.18(rpm/1000)2xRR:radiusrpm:roundperminute离心机的分类分离因数KC：离心力与重力之比（即U2T/Rg）根据KC分为常速KC<3000（6000rpm)高速KC=3000~50000（25000rpm)超速KC>50000（90000rpm)离心机使用注意事项挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品。离心机的正确操作方法离心管的安放：平衡离心速度的设定离心力与离心率离心速度必需根据离心样品的平均密度确定ForAngleRotorForSwingRotor使用后的维护与保养注意腔底的周边清洁O圈的作用密闭真空，防止样品飞溅生物安全防护，阻止有害生物样品外泄增加盖子与转子体的阻尼，防止盖子松脱ThermoForma

高温灭菌二氧化碳培养箱

工作原理通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境如：恒定的酸碱度（pH值：7.2-7.4）稳定的温度（37°C）较高的相对湿度（95%）稳定的CO2水平（5%）来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。

二氧化碳培养箱的基本的要求一是能够对温度、二氧化碳浓度和湿度提供最精确稳定的控制二是能够对培养箱内的微生物污染进行有效的防范，并且能够定期消除污染温控系统温度控制

根据加热方式分为气套式和水套式具备相互独立三重温度控制功能的二氧化碳培养箱，即箱内温度控制、超温报警控制和环境温度监控。

二氧化碳浓度控制红外传感器（IR）或热导传感器（TCD）

带有CO2测量系统自动校准功能

防污染设计和消毒灭菌系统紫外消毒HEPA过滤器高温消毒高温干热和高温湿热

高压消毒锅相关概念介绍灭菌（sterilization）是指杀灭一切活的微生物。消毒（disinfection）是指杀灭病原微生物和其他有害微生物，并不要求清除或杀灭所有微生物。方法灭菌方法可分为四种：物理、机械、化学和生物灭菌。一般多采用物理方法，如高温热力、滤过、超声波、紫外线和电