酶工程-第4章-酶的固定化

第四章酶的固定化

2——专一性强

——催化效率高

——作用条件温和等4.1.1固定化酶的定义酶催化的优点：（1）酶的稳定性较差

（2）酶的一次性使用

（3）产物的分离纯化较困难酶催化的缺陷为什么要将酶固定化?4——如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊

的相，使它与整体相（或整体流体）分

隔开，但仍能进行底物和效应物（激活

剂或抑制剂）的分子交换。

——这种固定化的酶既具有酶的催化特性，

又具有一般化学催化剂能回收、反复使

用等优点，并且生产工艺可以连续化、

自动化。设想5进展1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶固定化酶的研究从20世纪50年代开始1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而制成固定化酶。20世纪从60年代起，固定化酶的研究迅速发展1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。6※

酶的固定化方法研究

※

固定化方法和载体开发

※

应用研究现状7

所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化酶的定义8“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme）

“固相酶”（solidphaseenzyme）9在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”（immobilizedenzyme）的名称。

固定化酶正式定名10（l）极易将固定化酶与底物、产物分开；

（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱

连续反应；

（3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；

（4）酶反应过程能够加以严格控制；

（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；

（6）较游离酶更适合于多酶反应；

（7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；

（8）酶的使用效率提高，成本降低。固定化酶与游离酶相比，具有下列优点:11缺点：（l）固定化时，酶活力有损失；（2）增加了生产的成本，工厂初始投资大；（3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子

底物，对大分子不适宜；（4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；（5）胞内酶必须经过酶的分离程序。12——酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。4.1.2固定化酶的制备方法13

制备固定化酶要根据不同情况（不同酶、不同应用目的和应用环境）来选择不同的方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原则。

一种固定化酶制备人参抗癌有效成份的方法（发明专利）

/patentfm/pt89/888258_3A08C.htm

固定化酶的制备原则14——必须注意维持酶的催化活性及

专一性，保持酶原有的专一性、

高效催化能力和在常温常压下

能起催化反应的特点。原则115——固定化应该有利于生产自动化、

连续化。原则216——固定化酶应有最小的空间位阻。原则317——酶与载体必须结合牢固，从而使

固定化酶能回收贮藏，利于反复

使用。原则418——固定化酶应有最大的稳定性，在制

备固定化酶时，所选载体不与废物、

产物或反应液发生化学反应。原则519原则6——固定化酶应易与产物分离。20原则7——固定化酶成本要低，应为廉价的、

有利于推广的产品，以便于工业

使用。21——充分考虑到固定化酶制备过程和

应用中的安全因素。原则822酶的固定化方法通常按照结合的类型进行分类固定化方法分类非化学结合法结晶法分散法物理吸附法离子结合法化学结合法共价结合法交联法包埋法网格型微囊型23

——1结晶法

——2分散法

——3物理吸附法

——4离子结合法（一）非化学结合法24

※就是使酶结晶从而实现固定化的方法。

※对于晶体来说，结晶的蛋白质既是

载体也是催化剂。

※可以提供非常高的酶浓度，这一点

对于活力较低的酶而言更具有优越性。1结晶法(crystallization)25——在不断的重复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低。结晶法的局限性26※通过酶分散于水不溶相中从而实现固定

化的方法。

※对于在水不溶的有机相中进行的反应，最

简单的固定化方法是将干粉悬浮于溶剂

中，

并且可以通过过滤和离心的方法将

酶进行分离和再利用。2分散法(dispersion）27

对于用在水不溶性溶剂中的固定化酶，有许多途径可以提高它们的反应速率。28①正确的体系和贮存状态使酶粉末充分分散，将有助于提高活力。

——在干燥过程中，加入多种化合物有助于酶的分散，这些化合物也作为稳定剂和保护剂发挥作用。29②通过与亲脂化合物的共价连接能增加酶

在有机相中的溶解度

——可以通过将其包埋在膜体系中或通过多相

反应来实现酶的固定化。30——利用各种固体吸附载体将酶或含

酶菌体吸附在其表面上而实现酶

固定化的方法。3物理吸附法(physicaladsorption)31——无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂

白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基

磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；

——天然高分子载体有淀粉、白蛋白等；

——大孔型合成树脂、陶瓷等；

——具有疏水基的载体（丁基或已基­-葡聚糖凝胶）

可以疏水性吸附酶，以及以单宁作为配基的纤

维素衍生物等载体。载体32优点：具有酶活性中心不易被破坏、酶高级

结构变化少、操作方便、条件温和、

载体廉价易得、可反复使用等。

缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等。33定义：酶通过离子键结合于具有离子交换

基的水不溶性载体的固定化方法。4离子结合法(ionadsorption)34——阴离子交换剂

如DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，

AmberliteIRA-93，410，900等；

——阳离子交换剂

如CM-纤维素，AmberliteCG-50，

IRC-50，IR-120，Dowex-50等。载体35——操作简单，

——处理条件温和，

——酶的高级结构和活性中心的氨基酸

残基不易被破坏，

——能得到酶活回收率较高的固定化酶。离子结合法的优点36——载体和酶的结合力比较弱，容易受

缓冲液种类或pH的影响，在离子强

度高的条件下进行反应时，酶往往

会从载体上脱落。缺点37迄今已有许多酶用离子结合法固定化，例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。38DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNaOH和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。固定化酶活力回收50-60％，水解乙酰—DL—A1a活力为600-800umol/g·h湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE—纤维素。39固定化青霉素酰化酶的生产40

——1共价结合法

——2交联法（二）化学结合法41原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，从而将酶固定在支持物上。

归纳起来有两类:

——一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。

——另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。1共价结合法(covalentbinding）42——或氨基、、或-羧基、巯基、

羟基、咪唑基、酚基等。

——参与共价结合的氨基酸残基不应是

酶催化活性所必需的，否则往往造

成固定后的酶活性完全丧失。可与载体共价结合的酶的功能团43共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比的优点

——酶与载体结合牢固，稳定性好，利于

连续使用，一般不会因底物浓度高或

存在盐类等原因而轻易脱落。44缺陷

——反应条件苛刻，操作复杂；

——会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分

活性中心。45——天然有机载体（如多糖、蛋白质、细胞）

——无机物（玻璃、陶瓷等）

——合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）所用载体分三类可使载体活化的方法已经有很多，主要的有

——重氮法

——叠氮法

——溴化氰法

——烷化法47酶蛋白中的游离氨基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基等参与此反应。

很多酶，尤其是酪氨酸含量较高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶、β-葡萄糖苷酶等能与多种重氮化载体连接，获得活性较高的固定化酶。（1）重氮法48（2）叠氮法49（3）溴化氰法50溴化氰法51溴化氰法能在非常温和条件下与酶蛋白的氨基发生反应，它已成为近年来普遍使用的固定化方法，尤其是溴化氰活化的琼脂糖已在实验室广泛用于制备固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。52（4）烷基化法三氯-均-三嗪三氯-均-三嗪纤维素53（5）活化酯法54（6）环氧化法55（7）高碘酸法56

要求载体惰性，且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团；必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中；所选择的偶联反应对酶的其他功能基团副作用尽可能少；尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。共价结合法中的几个影响因素57定义：是指借助于双功能或多功能试剂能

使酶分子之间发生交联作用，而利

用双功能试剂或多功能试剂使酶与

酶之间交联，制成网状结构固定化

酶的方法。2交联法（cross-linking）58——N末端的-氨基

——赖氨酸的-氨基

——酪氨酸的酚基

——半胱氨酸的巯基

——组氨酸的咪唑基等参与交联反应的酶蛋白的功能团——形成希夫碱的戊二醛，

——形成肽键的异氰酸酯，

——发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或

N，N’-乙烯双马来亚胺等。

最常用的交联剂是戊二醛。交联剂/doc/70270/149550.html60戊二醛在蛋白质化学方面的应用由于戊二醛具有提高生物高分子材料的寿命和强度、消毒、灭菌、防腐以及消除抗原等特性，上世纪随着生物高分子材料的开发，戊二醛的应用研究得到了突破性进展。戊二醛与蛋白质交联的特点是活性高、反应快、结合量大、产物稳定、对沸水、酸、酶的抵抗能力强。用戊二醛制备的许多种生物组织材料具有消除抗原、减小排异反应和优异的血相容等优点，可用于人体脏器的修复。采用0.3%戊二醛溶液为交联剂得到的固定化木瓜蛋白酶具有很高的活性回收率，广泛用于啤酒和饮料澄清、肉类嫩化和复配消化药物等方面，有利于提高这种酶的利用率和降低生产成本。以氨丙基多孔硅球作载体，用戊二醛作交联剂制备的固定化嗜热菌蛋白酶在水相中能较好的合成二肽甜味剂Aspartame前体，最高产率可达95%，并具有良好的重复使用性能。将胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和辣根过氧化物酶通过戊二醛交联反应，固定在牛血清蛋白上，可制成一种高灵敏度的胆固醇生物传感器用的传感膜。62——制备的固定化酶一般比较牢固，可以长

时间使用。

——固定化的酶活回收率一般较低。

——降低交联剂浓度和缩短反应时间有利于

固定化酶比活的提高。

特点63定义：将酶包埋在各种多孔载体中使酶固定化的方法。

——网格型

——微囊型

/medicine/pro/pharmacy/2006-12-31-313102.shtml（三）包埋法(entrapment)64——将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微

网格中的称为网格型网格型（gel(lattic)entrapment）65——聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等

合成高分子化合物

——淀粉、蒟蒻粉、明胶、胶原、海藻酸

和角叉菜胶等天然高分子化合物常用的载体材料66——将酶或微生物包埋在高分子半透膜

中的称为微囊型。微囊型（microencapsulation）67制备微囊型固定化酶方法——界面沉淀法——界面聚合法——二级乳化法——脂质体包埋法68——包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸

残基进行结合反应，很少改变酶的高

级结构，酶活回收率较高。

——但是在包埋时发生化学聚合反应，酶

容易失活，必须巧妙设计反应条件。特点69——仅小分子可以通过高分子凝胶的网格扩

散，且这种扩散阻力会导致固定化酶动

力学行为的改变，降低酶活力。

——包埋法只适合作用于小分子底物和产物

的酶，对于那些作用于大分子底物和产

物的酶是不适合的。70各种固定化酶方法的优缺点比较特性物理吸附法离子结合法共价结合法交联法包埋法制备易易难难易结合力中弱强强强酶活力高高中中高底物专一性无变化无变化有变化有变化无变化再生可能可能不可能不可能不可能固定化费用低低中高中适用性酶源多较广较广小分子底物、药用酶广泛71

4.2辅酶的固定化1.辅酶的定义——约1/3的酶的催化反应需要另一种非蛋白

质性质的小分子化合物，这些小分子物

质统称辅因子。——简单的金属离子，例如Mg2+，Mn2+等

无机辅因子。

——一种与酶蛋白或紧或松地联结在一起的

有机物质，即有机辅因子。

72其中有机辅因子有两类

——辅酶

——辅基73——从某反应向另一反应传递物质

——与酶蛋白结合得比较松散

——往往能够通过透析法除去。辅酶（酶间载体）74——脱氢酶反应中需要的辅酶I（NADH和

NAD+）和辅酶II（NADPH和NADP＋）

能传递电子；

——连接酶在催化生物合成反应中所需要的

ATP能传递磷酸基，以及辅酶A（CoA）

能传递乙酰基等。75——与酶蛋白结合相当紧密，用透析法不

易除去，必须经过一定的化学处理才

能使之分离。

——是酶活性中心的组成部分。辅基（酶内传递）76——过氧化氢酶中的铁卟啉，黄素酶类

中的黄素核苷酸（FMN和FAD）及

B6、B12等。77辅酶固定化的目的——有机辅因子的价格较昂贵，在工业上

应用全酶的关键是有机辅因子的保留

和再生。78——辅基与酶蛋白的结合比较牢固，用超

滤膜截留等物理方法进行回收。

——对于辅酶，直接用超滤膜截留并不理

想。将辅酶固定在可溶性的或不可溶

性的大分子载体上，这样就便于回收

再生。79辅酶的固定化方法——辅基的固定化——辅酶的固定化

80——应选择合适的载体

——间隔臂（手臂）的选择辅基的固定化81——没有特异性吸附

——具有多孔性

——有适合引入配基的官能团

——化学稳定性

——具有适当的机械强度等。理想的载体应具有以下的条件82——琼脂糖

——纤维素

——玻璃珠

——合成高分子载体等。目前使用的载体83——需要0.5~1.0nm长的手臂

——考虑辅基的性质间隔臂（手臂）的选择84——在不影响辅基活性的分子部位引入适当的

功能团。

——一般引入羧基或氨基后，与载体偶联比较

容易。

——如果辅基分子本身具有不参与催化活性的

适当的功能团时，就不必预先引入功能团。85——一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以

及重氮偶联法等共价偶联，或将其进

行适当的化学修饰后用在超滤器中。辅酶的固定化86辅酶NAD+在琼脂糖上的固定化8788辅酶的高分子化⑴引入功能团和间隔臂

——辅酶引入的功能团主要是氨基或羧基。⑵高分子化具有羧基的辅酶衍生物可以用碳二亚胺的缩合反应使其与具有氨基的聚赖氨酸、聚乙亚胺等水溶性高分子结合而高分子化。不预先引入功能团，用一步反应也能实现高分子化。在辅酶高分子化过程中水溶性高分子的选择也很重要。首先其溶解度要大，分子大小要适当，使其能保持在半透膜内；分子过大会增加溶液黏度和影响辅酶活性。高分子化辅酶的活性与高分子大小、结构、疏水性、亲水性的程度，解离基的有无和种类，结合于高分子的辅酶量等有关。894.2.3辅酶的再生根据辅酶和酶的固定化情况，需要辅酶的酶反应系统一般有如下几种类型：

（1）辅酶和酶均不固定的反应系统；

（2）辅酶不固定而酶固定的反应系统；

（3）辅酶固定而酶不固定的反应系统；

（4）辅酶和酶分别固定的反应系统；

（5）辅酶和酶共固定的反应系统；

（6）辅酶与酶分子偶联形成辅酶-酶复合物的反应

系统。90辅酶固定化的反应系统91——一个酶的活性中心能与另一个酶的活性

中心相互定向，而辅酶与其中一个酶分

子相结合，它的手臂分子的长度又适于

辅酶分子与两个酶的活性中心相互作用。

——辅酶能在两个酶的活性中心之间进行游

摆从而得到再生。最理想的构型92固定化酶的性质931固定化对酶活性及酶反应系统的影响

固定化后酶活性变化：

固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。

4.3固定化酶催化反应动力学94例如

用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30%，而对低分子底物苯酞精氨酸-对硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。95在同一测定条件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：

①酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；

②固定化后，酶分子空间自由度受到限制(空间位阻)，会直接影响到活性中心对底物的定位作用；

③内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；

④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能过膜与酶接近。96值得注意的是

——有个别情况，酶在固定化后反

而比原酶活力提高。

——原因可能是偶联过程中酶得到化

学修饰，或固定化过程提高了酶

的稳定性。97酶的稳定性包括

——热稳定性

——对各种有机试剂稳定性

——对酶抑制剂的稳定性

——对不同pH（酸度）稳定性

——对蛋白酶稳定性

——贮存稳定性

——操作稳定性2固定化对酶稳定性的影响98Merlose曾选择50种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比较，发现其中有30种酶经固定化后稳定性提高，12种酶无变化，只有8种酶稳定性降低。99热稳定性

固定化酶的稳定性变化固定化酶；2.自然酶100——酶固定化后，对底物作用的最适pH和

pH-活性曲线常常发生偏移

——一般说来，用带负电荷载体制备的固定

化酶，其最适pH和pH-活性曲线较游离

酶偏高；反之，使用带正电荷的载体其

最适pH向酸性偏移固定化酶的最适pH变化101pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响1.固定化酶；2.游离酶102——酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。

——当然，也有报道最适温度不变或下降的。3固定化酶的最适温度变化103

固定化后酶稳定性提高的原因，可能有以下几点：

①固定化后酶分子与载体多点连接，增加了

酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸

展变形。

②阻挡了不利因素对酶的侵袭。

③抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，

由于酶失去了分子间相互作用的机会，从

而抑制了自降解。1044影响固定化酶性能的因素——固定化酶制备物的性质取决于所用的酶

及载体材料的性质。——酶和载体之间相互作用使固定化酶具备

了化学、生物化学、机械及动力学方面

的性质。

105成分参数酶生物化学性质分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）动力学参数专一性，pH及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对pH，温度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性。载体化学特征化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性机械性质颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅拌罐的磨损。固定化酶固定化方法所结合的蛋白，活性酶的产量，内在的动力学参数（即无质量转移效应的性质）质量转移效应分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。稳定性操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性效能生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）固定化酶的特征参数106固定化酶在工业生产上的应用乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—AlaAminoacylase氨基酰化酶1969年日本利用固定化氨基酰酶，由乙酰化-DL-氨基酸连续生产L-氨基酸获得成功，是世界上固定化酶大规模应用的首例。1974年以来，已能将米曲霉的氨基酰化酶固定在DEAE-Sephadex上生产出L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸等。工业成本降低约40％，产品广泛应用于食品、医疗、农业等等。107世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。葡萄糖异构酶108采用固定化葡萄糖异构酶酶生产高果糖浆，生产能力达到lkg固定化酶转化成42型果葡萄浆7～8吨。用α-淀粉酶将玉米粉水解生成寡糖，再用葡萄糖淀粉酶处理产生95％~97％葡萄糖。由于葡萄糖的甜度比蔗糖低得多，所以利用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构化