细胞生物学-5细胞研究技术汇总

照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；2.

光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.

有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。第五章细胞研究的细胞生物学技术暗视野显微镜

暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。第五章细胞研究的细胞生物学技术倒置显微镜

组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜。

在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。第五章细胞研究的细胞生物学技术激光共聚焦扫描显微镜负责人罗禹电话：82655077

激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。第五章细胞研究的细胞生物学技术物镜弧光灯荧光滤光镜聚焦光圈目镜滤光镜激光器检测针孔光源针孔光电倍增管荧光显微镜的工作原理激光扫描共聚焦显微镜的工作原理滤光镜物镜荧光滤光镜第五章细胞研究的细胞生物学技术激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。第五章细胞研究的细胞生物学技术激光器的特点:1)方向性好:激光基本沿直线传播。2)单色性好:=10-8nm。3)高亮度:激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集中的。4)偏振性:激光为平面偏振光,光纤耦合。激光扫描共焦显微镜的设计特点：1)点照明2)具有照明pinhole和探测pinhole3)照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4)具有扫描系统——逐点扫描成像5)具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物第五章细胞研究的细胞生物学技术激光共聚焦显微镜的应用单、双、三,四色标记检测。精确的一、二、三、四维观察。高品质的荧光成像、透射成像、物体表面反射成像。静态和动态观察(CA2+,pH,膜电位,膜流动性等)。定性以及定量分析。特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。第五章细胞研究的细胞生物学技术细胞内自由基的变化第五章细胞研究的细胞生物学技术细胞内NO的变化第五章细胞研究的细胞生物学技术细胞膜蛋白相互作用第五章细胞研究的细胞生物学技术原子力显微镜利用原子之间的范德华力（VanDerWaalsForce）作用来呈现样品的表面特性。

第五章细胞研究的细胞生物学技术

第五章细胞研究的细胞生物学技术

扫描电子隧道显微镜第五章细胞研究的细胞生物学技术二、显微操作技术

显微操作技术（micromanipulationtechnique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。

第五章细胞研究的细胞生物学技术三、图像分析系统主要用于照片、实物、组织切片、细胞爬片等组织化学取图和灰度分析。免疫组织化学检测细胞内源MAPKp42蛋白表达E

第五章细胞研究的细胞生物学技术三、激光显微切割技术

第五章细胞研究的细胞生物学技术第四节细胞培养技术一、细胞培养的基本条件无菌操作室、超净工作台（生物安全柜）、倒置显微镜、CO2培养箱、消毒设备、超声清洗仪、烤箱、离心机、蒸馏水器（超纯水）、液氮罐、冰箱、滤器以及天平等。相关设备：流式细胞仪、微板测试系统。二、细胞培养的基本知识培养细胞的基本概念原代培养：直接从活体组织中分离出细胞，在培养条件下传1至10代的培养方法。原代培养一般不能传代太多，否则培养细胞会走向衰老死亡。传代培养：经过一定处理，细胞适应在体外条件下连续传代的培养方法。第五章细胞研究的细胞生物学技术

细胞株（cellline）：一般可传40至50代的细胞。

细胞系（cellstrain

）：细胞株经过转化后可传50代以上或无限传代的细胞。第五章细胞研究的细胞生物学技术原代培养细胞的生命归宿

原代培养期

传代期

衰退期第五章细胞研究的细胞生物学技术2.培养细胞的生长方式和类型生长方式：贴附生长型、悬浮生长型。类型：上皮样细胞、成纤维样细胞。3.培养细胞的生长特点细胞生长过程存在三个过程：滞留期：细胞接种于新的培养瓶中，细胞开始贴壁，细胞形态由圆形恢复原来形态的时期。此时，细胞尚未进入增殖期。对数生长期：细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最强的时期。适用于实验研究。平台期：细胞生长的底面积被生长的细胞占满，由于接触抑制而细胞停止增殖的时期。4.细胞培养的注意事项实验细胞密度、培养基储存时间、细胞培养传代数（衰退期）。第五章细胞研究的细胞生物学技术第五章细胞研究的细胞生物学技术三、细胞系建立的方法原代培养的方法（1）组织块培养法（2）消化培养法细胞纯化的方法（1）自然纯化（2）人工纯化酶消化法、差速贴壁法、机械铲除法、克隆法、培养基限定法以及流式细胞仪分离法。第五章细胞研究的细胞生物学技术四、培养细胞生长的条件细胞的营养需要细胞的生存环境温度:37℃

O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

渗透压无污染无毒第五章细胞研究的细胞生物学技术五、细胞检测

计数血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数第五章细胞研究的细胞生物学技术细胞克隆形成率实验

单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力。

克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数

缺点：操作繁琐

优点：精确、可靠

台盼蓝法

活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞恬力。

第五章

细胞研究的细胞生物学技术第五章细胞研究的细胞生物学技术

四唑盐（MTT）比色法

四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值

MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。第五章细胞研究的细胞生物学技术六、细胞冻存和复苏

冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水