Hela细胞传代培养课件

Hela细胞传代培养实验目的：掌握动物细胞培养的基本原理和方法。实验用具：离心管（2支），移液枪（每个台面一把），枪头（每个台面一盒），吸管（4根），培养皿（每组2个）实验药品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640培养基培养板清洁液的配制HeLa是HenriettaLacks的简称，HenriettaLacks是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。

细胞培养的甚本概念传代细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。

原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。

每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期

细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

10分钟一4小时贴壁期细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）

潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。

对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。培养细胞生长的条件1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2

。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。2细胞培养用液的配制D-Hanks原液试剂配方氯化钠80.0g

磷酸氢二钠（NaHPO·2HO）0.6g

氯化钾4.0g

磷酸二氢钾0.6g

三蒸水1000mlD-Hanks工作液试剂配方D-Hanks原液100ml

三蒸水896ml

0.5%酚红液4mlD-Hanks工作液试剂配方D-Hanks原液100ml

三蒸水896ml

0.5%酚红液4ml消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用合成培养基

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。

无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定完全培养基的组成基础培养基80％一95％血清5％一20％（一般加10％）碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100卑位／毫升实验前的准备培养基的配置RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2加血清（终浓度10％）消化液的配置胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用D－hanks配置。配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌实验步骤1.打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。2．从冰箱中取出0.25％胰酶、D－Hanks、培养基。可以把胰酶和D－Hanks的瓶盖打开或者拧松。3.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，加入D－Hanks。轻轻摇动后将Hanks弃掉。4.用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇动。2－5分钟后迅速将消化液吸出。消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。否则细胞会变死。在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消化适宜。5．取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。6．至所有细胞从培养皿底部脱落下来，然后吸取至离心管中。1000rpm离心5分钟。（无需准确计数时离心可略）7．细胞离心毕，尖吸管弃去上清，吸取培养基适量，加入离心管，将