帖航,乳糖操纵子

乳糖操纵子的结构及其正负调控天津商业大学生物工程类1002班帖航2/6/20231一.乳糖操纵子的提出

大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长。葡萄糖效应（葡萄糖阻遏或分解代谢物阻遏作用），大肠杆菌的2次生长。2/6/20232这种典型的诱导现象，是研究基因表达调控极好的模型。针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的Jocob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于1961年提出乳糖操纵子（lac

operon）学说，在1965诺贝尔医学生理学奖。FrançoisJacob

JacquesMonod

2/6/20233二、乳糖操纵子的基本组成

乳糖操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本单元，由调节基因、启动子（P）、操作区（O）、结构基因、和终止子和组成。2/6/20234结构基因群

操纵子中被调控的编码蛋白质的基因称为结构基因(structuralgene,SG)。每个结构基因是一个连续的开放阅读框(openreadingframe),5’端有起始密码ATG，3’端有终止密码TAA、TGA或TAG。

Z基因5’侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（RBS）特征的Shine-Dalgarno(SD)序列。由于ｚ、ｙ、ａ三个基因头尾相接，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。2/6/20235ｚ基因长3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为135,000的多肽，以四聚体形式组成有活性的β-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为半乳糖和葡萄糖；ｙ基因长780bp，编码有260个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；

ａ基因长825bp，编码275氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。

2/6/20236启动子

启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5＇侧上游，控制整个结构基因群的转录。

2/6/20237操纵区

操纵区（operator）是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱。Promotor:-84---+1Operator:-7---+28两者有7bp重叠，使这段序列可能无法同时结合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能虽然可以同时结合，但无法形成开放的转录起始复合物2/6/20238调控基因

调控基因(regulatorygene)是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。调控蛋白有：阻遏蛋白(repressiveprotein)：与操纵区结合后能减弱或阻止其调控的基因转录，其介导的调控方式为负调控(negativeregulation),

；

激活蛋白(activatingprotein)（或无辅基诱导蛋白（apoinducer)

）：与操纵区结合后能增强或起动其调控的基因转录，所介导的调控方式为正调控(positiveregulation)。乳糖操纵子中，调控基因lacI位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的阻遏蛋白R。2/6/20239终止子

终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。2/6/202310

终止子都在结构基因的附近，只能对同一条DNA链上的基因表达起调控作用，这种作用在遗传学实验上称为顺式作用（cis-action），启动子、操纵子和终止子就属于顺式作用元件（cis-actingelement）。调控基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它是通过其基因产物──调控蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条DNA链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用（trans-action），调控基因就属于反式作用元件（trans-actingelement），其编码产生的调控蛋白称为反式调控因子（trans-actingfactor）。由此也可窥测到基因表达调控机理的关键在蛋白质与核酸的相互作用上。2/6/202311二、乳糖操纵子的表达调控

阻遏蛋白的负调控CAP的正调控2/6/2023121.阻遏蛋白的负调控

当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵子处于阻遏状态。此ｉ基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子ｏ结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动。R的阻遏作用不是绝对的，R与ｏ偶尔解离，使细胞中还有极低水平的－半乳糖苷酶及透过酶的生成。PstructuralgenesOlacZ

lacY

lacAIR2/6/202313当有乳糖存在时，乳糖受－半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合，使R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与ｏ的亲和力，与ｏ解离，基因转录开放，使－半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵子的诱导作用。

β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷通透酶β-半乳糖苷乙酰基转移酶lacZ

lacY

lacA别乳糖等诱导物IPOR2/6/2023142.CAP的正调控

细菌中的cAMP（环化腺苷酸）含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生成少而分解多；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP(cAMPreceptorprotein)，当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP(CRP-cAMPactivatedprotein)(分解代谢基因激活蛋白)，能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。

CAP结合位点（CAPbindingsite）在lac操纵子的启动子Plac上游端，当CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP不能被活化，lac操纵子的结构基因表达下降。2/6/2023152/6/202316由此可见，正调控与负调控并非互相排斥的两种机制，而是生物体为适应环境而进行的一种协同机制。

Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。2/6/202317无葡萄糖cAMP浓度高mRNA无乳糖时有乳糖时有葡萄糖cAMP浓度低RNA-polOOOOlac操纵子基因表达既需要乳糖又需缺乏葡萄糖2/6/202318Summary2/6/202319利用lacZ′基因的插入失活筛选重组子

—蓝白筛选法

载体同时含氨苄青霉素抗性基因和lacZ′基因，外源基因插在lacZ′基因内，受体细胞为lacZ′基因互补菌。在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂（X-gal）的平板上筛选：未转化细胞不能生长；空载体转化菌长成蓝色菌落；重组子长成白色菌落。lacZ基因编码β-半乳糖苷酶；lacZ′基因编码β-半乳糖苷酶的N端序列α片段，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端片断，两者互补（α-互补）形成有功能的全酶。补充内容2/6/202320X-gal