微生物学病毒与亚病毒

微生物学病毒与亚病毒第一页，共四十三页，2022年，8月28日第一节病毒的性质一、形态结构二、病毒的化学组成三、病毒的理化抗性第二页，共四十三页，2022年，8月28日一、形态结构1.形态和大小形态多样,100nm以下。2.结构：核(衣)壳+核酸或包膜（来源于核膜或细胞膜）。第三页，共四十三页，2022年，8月28日衣壳对称类型螺旋对称二十面体对称复合对称第四页，共四十三页，2022年，8月28日二、化学组成（一）病毒的核酸（DNA或RNA）1.正极性和负极性正极性(+RNA)：可作为mRNA。负极性(-RNA)：与其mRNA序列互补。双意RNA：正极性+负极性。DNA：和mRNA互补→-DNA；和mRNA序列相似→+DNA。2.感染性核酸（infectiousnucleicacid）抽提分离的病毒核酸→导入细胞→产生子代毒粒。第五页，共四十三页，2022年，8月28日（二）病毒的蛋白质含量多（40-90%）；种类少（一种或几种）；多为结构蛋白，少为功能蛋白(酶)。1.结构蛋白（1）壳体蛋白：保护，参与吸附侵入。（2）包膜蛋白包膜糖蛋白：吸附，启动感染和侵入。基质蛋白：支撑包膜，介导核壳与包膜糖蛋白的识别。第六页，共四十三页，2022年，8月28日2.功能蛋白-毒粒酶（1）参与侵入、释放：如T4噬菌体溶菌酶。（2）参与合成：如转录酶、逆转录酶等。（三）、脂类和糖类都来源于细胞；种类和含量同于宿主细胞（磷脂+胆固醇）;注：少数无包膜病毒（T系噬菌体、λ噬菌体等）也有脂类。第七页，共四十三页，2022年，8月28日三、理化抗性1.温度耐冷不耐热，离体，56～60℃，30min→灭活。保存：低温真空干燥法(-20～-196℃)；适量盐溶液（MgCl2，MgSO4）可提高热稳定性。2.射线击毁病毒核酸。活性染料（如甲苯胺兰、中性红、丫啶橙）渗入并与核酸结合→可见光灭活。3.pH：5.0～9.0稳定。第八页，共四十三页，2022年，8月28日4.脂溶剂破坏包膜，如乙醚、氯彷→分类的依据。5.化学消毒剂对氧化剂（如高锰酸钾、次氯酸盐）敏感；酒精、酸碱、环氧乙烷可杀灭。

6.抗生素不敏感，但患病须注射。第九页，共四十三页，2022年，8月28日第二节病毒的研究方法一、分离与纯化二、效价测定三、病毒的鉴定第十页，共四十三页，2022年，8月28日一、分离纯化（一）分离1.标本采集与处理（1）采集：有足够活病毒。如倒罐液，感染者血液、分泌物等。（2）处理除菌：采用抗生素、离心、过滤等；接种第十一页，共四十三页，2022年，8月28日2.接种与感染表现（1）接种考虑宿主范围、组织嗜性；操作简单、易培养、易判断。注：盲传：第一次接种未出现症状，重复接种。目的：提高效价。盲传二代后，仍未症状→无病毒。第十二页，共四十三页，2022年，8月28日（2）感染表现噬菌斑、坏死斑（枯斑）、蚀斑（空斑）。①噬菌斑（plaque）噬菌体→平板培养物→圆形的透明区域。有一定的形态，用于分离、鉴定和计数。噬菌斑第十三页，共四十三页，2022年，8月28日②坏死斑（枯斑）植物病毒→敏感植物叶片→坏损区域。③蚀斑（空斑）动物病毒→细胞单层上→病损区。细胞内部发生“致细胞病变效应”（细胞聚集成团、肿大、融合成多核细胞，有包涵体或裂解）。第十四页，共四十三页，2022年，8月28日包涵体(inclusionbody)光镜下可见、圆形、卵圆形或不定形的蛋白质结晶。组成多为病毒颗粒或病毒亚基；少为细胞对感染的反应产物，无病毒粒子。实践应用病毒诊断—大小、形态、数量、组成以及位置→快速鉴别→辅助诊断。

用于生物防治—昆虫病毒→多角体（碱性蛋白）→杀虫。第十五页，共四十三页，2022年，8月28日（二）、病毒的纯化1.标准（1）保持感染性；（2）大小、形态、密度、组成及抗原性均一。2.方法盐析、等电点沉淀、凝胶层析、离子交换等；超速离心第十六页，共四十三页，2022年，8月28日二、效价测定效价：指1mL培养液或试样中病毒感染单位数目（噬菌斑形成单位数或感染中心数）。1.物理颗粒计数：电镜。2.感染性测定：测噬菌斑、枯斑(须用石英砂摩擦叶片)和蚀斑数。第十七页，共四十三页，2022年，8月28日底层培养基2-4ml上层培养基0.2ml敏感菌悬液0.1ml噬菌体试样上层培养液噬菌斑37℃，12h双层平板法第十八页，共四十三页，2022年，8月28日三、鉴定1.宿主范围及感染表现宿主谱→初步鉴定。疾病症状、单层细胞培养物的致病变效应。2.理化性质大小、形态、沉降系数、相对分子质量、核酸类型等。3.血细胞凝集吸附红血细胞→凝集(如流感病毒+鸡红血cell)。病毒不同→红血细胞种类、凝集温度、pH不同。第十九页，共四十三页，2022年，8月28日4.病毒的血清学试验鉴定血凝抑制试验：特异病毒抗体+病毒→抑制凝集。中和试验：病毒+抗体→感染性丧失。5.分子生物学鉴定鉴定核酸、蛋白质性质。如N-氨基酸分析、核酸酶切图谱和寡核苷酸图谱分析等。第二十页，共四十三页，2022年，8月28日第三节病毒复制一、病毒的增殖过程二、一步生长曲线

（one-stepgrowthcurve）第二十一页，共四十三页，2022年，8月28日一、病毒的增殖过程（E.coliT4噬菌体）吸附、侵入、生物合成、装配和释放。（一）吸附

1.特异性吸附蛋白（VAP）→→细胞受体（细胞生长必须）。

2.原理：空间结构的互补性，氢键、疏水性相互作用、范德华力。第二十二页，共四十三页，2022年，8月28日（二）侵入1.噬菌体：注射。2.动物病毒直穿细胞膜；细胞内吞：累积在细胞质的小泡内→释放；膜融合：包膜和细胞膜融合。3.植物病毒：伤口或口器侵入。第二十三页，共四十三页，2022年，8月28日（三）生物合成

1.特点：时序性。

早期转录→→次早期转录→→晚期基因表达。以E.coli的T偶数双链噬菌体为例。第二十四页，共四十三页，2022年，8月28日早期mRNA早期蛋白(次早期RNA聚合酶)次早期mRNA次早期蛋白(DNA分解酶、DNA、mRNA聚合酶等)晚期mRNA晚期蛋白(衣壳蛋白、装配酶等)核酸(DNA)复制宿主细胞RNA聚合酶dsDNA次早期DNA晚期基因第二十五页，共四十三页，2022年，8月28日2.核酸复制（1）基本规律dsDNA、dsRNA通过半保留复制。ssDNA或ssRNA先合成双链中间体,再复制。（2）病毒DNA复制有6种方式双链DNA复制：半保留方式。单链DNA复制

所有ssDNA病毒的核酸均为+DNA。先由+DNA→→±DNA→→

-DNA→→mRNA和+DNA。第二十六页，共四十三页，2022年，8月28日双链RNA复制

-RNA→mRNA→蛋白质→dsRNA模板→子代dsRNA。侵染性单链RNA复制

+RNA→-RNA→子代+RNA。非侵染性单链RNA复制

-RNA→+RNA(即mRNA)→RNA复制酶→

“+RNA”为模板→-RNA。第二十七页，共四十三页，2022年，8月28日逆转录病毒单链RNA复制有RNA-DNA杂交分子和双链DNA中间体。RNA→反转录酶作用→RNA-DNA分子→DNA聚合酶作用→双链DNA→整合到染色体DNA→脱离后，子代单链RNA。第二十八页，共四十三页，2022年，8月28日（四）、装配（五）、释放裂解和出芽。第二十九页，共四十三页，2022年，8月28日二、一步生长曲线（描述烈性噬菌体的复制）1.具体操作敏感菌+噬菌体（10/1)。噬菌体抗血清→去除游离噬菌体。将培养液高倍稀释→终止抗血清作用。定时取样0.5mL+0.5mL敏感菌悬液+5mL半固体培养基混匀→37℃培养，12h→观察测定噬菌斑数。绘制一次生长曲线（以感染时间为横坐标，噬菌斑数为纵坐标）。第三十页，共四十三页，2022年，8月28日时间噬菌斑数潜伏期裂解期平稳期一步生长曲线2.三个特征数据：潜伏期，裂解期和裂解量。裂解量=稳定期病毒效价/潜伏期病毒效价第三十一页，共四十三页，2022年，8月28日第四节非增殖性感染与缺损病毒侵染后，不产生有感染性子代病毒粒子。一、非增殖性感染的类型1.流产感染(abortiveinfection)2.限制性感染(restrictiveinfection)3.潜伏感染(latentinfection)第三十二页，共四十三页，2022年，8月28日1.流产感染（1）依赖于细胞非允许细胞不能复制(缺乏复制酶、tRNA或细胞因子)如：人肾细胞允许→人腺病毒；猴肾细胞非允许。（2）依赖于病毒病毒基因组不完整。病毒第三十三页，共四十三页，2022年，8月28日2.限制性感染

细胞瞬时允许，病毒不能复制或仅有少数细胞产生病毒。如：人乳头瘤病毒，感染各分化期的上皮细胞，不能晚期转录。感染分化成熟的鳞状上皮细胞→晚期转录。3.潜伏感染在细胞内，不产病毒，不破坏细胞。可由病毒基因表达，改变宿主→恶性细胞。第三十四页，共四十三页，2022年，8月28日二、缺损病毒主要为基因组有缺陷，须依赖其他病毒才能复制。1.干扰缺损病毒(干扰缺损颗粒)

(defectiveinterferingparticles)——DI颗粒2.卫星病毒3.条件缺损病毒4.整合的病毒基因组第三十五页，共四十三页，2022年，8月28日1.DI颗粒复制时产生的基因缺失突变体。各病毒均可产生，在高感染复数(m.o.i)时产生频率最高。

m.o.i：每一敏感细胞表面吸附病毒的数量。

m.o.i=1-300须依赖于同源完全病毒才能复制。DI颗粒基因组小→复制迅速→干扰完全病毒复制。第三十六页，共四十三页，2022年，8月28日2.卫星病毒绝对缺损，形态结构、抗原性与辅助病毒不同，少有同源性。卫星病毒：E.coliP4噬菌体(缺壳体蛋白编码基因)辅助病毒：E.coliP2噬菌体壳体蛋白（合成P4噬菌体外壳）第三十七页，共四十三页，2022年，8月28日3.条件缺损病毒

条件致死突变体，在允许条件→正常增殖；非允许条件→流产感染或死亡。4.整合的病毒基因组温和噬菌体和肿瘤病毒。（1）温和噬菌体核酸都是dsDNA。存在形式游离噬菌体（游离态）原噬菌体（整合态或质粒形式）营养噬菌体（营养态）第三十八页，共四十三页，2022年，8月28日（2）溶源菌①特征溶源性可遗传可（自发或诱发）裂解有免疫性复愈：辐射或氮芥处理，有些菌体会失去原噬菌体。溶源转变：除免疫性以外获得新性状。局限转导第三十九页，共四十三页，2022年，8月28日②检出方法紫外线照射；将少量溶源菌和大量敏感菌混合，倒平板培养，观察。出现独特噬菌斑→溶源菌。敏感菌菌苔溶源菌菌落透明裂解斑第四十页，共四十三页，2022年，8月28日（3）肿瘤病毒的整合感染肿瘤病毒（如乙肝病毒）或RNA病毒，一定条件下可转入复制循环，产生子代病毒。DNA病毒：直接整合。RNA病毒：如逆转录病毒。第四十一页，共四十三页，2022年，8月28日第五节亚病毒一、卫星RNA（拟病毒）单链