液相色谱中12演示教学

液相色谱中12一.按分配机理的层析分类凝胶过滤色谱离子交换色谱反相色谱疏水色谱亲和色谱离子交换剂（P143）高分子类交换剂：Sephadex,Sepharose,BioGel,Cellulose等三.离子交换色谱的分离原理与操作常用的离子交换树脂强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH,-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基团；强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-ß-羟基乙基胺基；弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；DEAEanionexchangerCMCCationExchanger2）、性能评价A 交换容量(exchangecapacity)

指单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数(mmol)，是表征交换剂离子交换能力的主要参数。B 交换容量的测定

对于阳离子交换剂：用HCl将其处理成氢型，称重并测定其含水量；称数克交换剂，加入到过量已知浓度的NaOH溶液，发生交换反应

待反应达到平衡后(强酸性的需要静置24h，弱酸性的需静置数日)，测定剩余的NaOH摩尔数，就可求得阳离子交换剂的交换容量。

对于阴离子交换剂：将阴离子交换剂转换成Cl型后，取一定量的Cl型交换剂，通入Na2SO4,

用铬酸钾作指示剂，用硝酸银溶液滴定流出液的Cl-，根据Cl-量计算交换容量。 蛋白质的交换容量：比小分子化合物要小的多(见表)。Why?1st树脂孔道的空间排阻作用大；2nd

交换后排阻其他蛋白质的扩散和交换；3rd

蛋白质的多电荷与多个交换中心结合

ionexchangechromatography（IEC）

定义：利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。三.离子交换色谱的分离原理与操作Oneprotein,PI=6.9Ifinthebuffer,pH=5.9Oneprotein,PI=6.9Ifinthebuffer,pH=7.9anion

exchangerscation

exchangers交换剂的选择?(p146)分离物质为两性离子,应根据其在稳定的pH范围内所带电荷来选择交换剂.strongionexchangers–适用的pH范围很广,常用来制备无离子水,分离在极端pH溶液中解离且较稳定的物质weakionexchangers--

适用的pH范围窄,但在pH为中性的溶液中交换容量也高,用于分离生命大分子物质,活性保持。离子交换层析的基本步骤

平衡上样吸附洗脱再生++++++-------anionexchangebeadEquilibrationSampleapplicationandwash-----------++++++----Elution----------------------------------++++++++++++--Regeneration-----------------------++++++SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------动画层析柱平衡

缓冲液的用量至少为柱体积的2倍

平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速

平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要

样品进柱

为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高洗脱1st

恒定洗脱缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽2nd

线性梯度洗脱(lineargradientelution)线性梯度洗脱的优缺点优点：流动相离子强度I、pH连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。3rd阶梯洗脱法(stepwiseelution)优点：无须特殊设备，操作简单；缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。样品洗脱1.一般用在工艺摸索初期，能快速的得到目的蛋白和杂蛋白的洗脱性质，减小配一系列盐浓度的工作量。2.根据线性梯度洗脱的结果，采用最佳的阶段洗脱方式。

离子交换色谱在操作上的注意之处注意各种厂家提供柱材料的pH范围；注意流速范围（压力范围），以免损坏胶颗粒。注意装柱（均匀，无气泡），保养（高盐再生）及贮存（加防腐剂）。准备样品使其处于与平衡缓冲液相同的pH及离子强度的环境之中，注意样品的溶解性，不要有沉淀产生及颗粒物质;样品中应该避免含有去污剂及尿素、硫脲等。样品总量不应超过柱的结合容量,上样体积一般无特殊的限制。在位清洗和在位消毒在位清洗（除去柱床的沉淀蛋白和顽固蛋白）除脂类、疏水蛋白的方法：使用递增式梯度以4～10CV70%乙醇或30%异丙醇洗柱，再用至少3CV蒸馏水过柱；或以0.5%非离子性去污剂（溶于1mol/L乙酸中）洗柱，再用5CV70%乙醇过柱，最后用4～10CV蒸馏水加以清洗。注意：亲和层析介质在位清洗方法需参见包装说明书在位消毒（将微生物感染降到最低）方法：用0.5～1mol/L氢氧化钠以该凝胶的建议流速洗柱，约0.5～1h然后以最少3CV平衡缓冲液过柱

优点处理量大，浓缩，高速；选择高，所需柱长较短；回收率高；离子交换剂种类多，价格也远低于亲和吸附剂。IEC特点缺点IEC的操作变量远多于GFC，影响分离特性的因素非常复杂。二.离子交换色谱的应用分离纯化（通用性；高选择性）

由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）操作要点

一、原理与操作1．疏水性相互作用层析的原理疏水性相互作用层析(Hydrophobicinteractionchromatography，HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。亲水性蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸等)含量较多的蛋白质疏水性基团多，疏水性也大。

四疏水性相互作用层析(P155)

尽管在水溶液中蛋白质具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的作用，但总有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基发生疏水性相互作用，被固定相(疏水性吸附剂)所吸附。疏水性吸附剂各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。常用的疏水性配基主要有苯基、短链烷基(c3～c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。因疏水性吸附作用与配基的疏水性(疏水链长度)和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，疏水性高的配基应较疏水性低的配基修饰密度低。一般配基修饰密度在（10～40）μmo1／cm3之间。配基修饰密度过小则疏水性吸附作用不足，密度过大则洗脱困难。

图7-12疏水性吸附剂

图中a的末端氨基以及a和b的键合亚氨基显弱碱性，在中性pH范围内带正电荷，因此，这类疏水件吸附剂除疏水性吸附外，还可能存在静电吸附(离子交换)作用。图中c的吸附剂利用醚键结合．不引入荷电基团，对蛋白质仅产生疏水性吸附作用。2)影响因素(p156)1st

水化层(hydrationshell) tighthydrationshell(0.35gwater/1gpro) loosehydrationshell(2gwater/1gpro)2ndionicstrength3rd|pH水

–pI|Value |pH水

–pI|Valuezeta电势水化层4th

增加亲水性物质 离子：SCN-，ClO4-，I-

有机物：乙二醇、丙三醇等含羟基物质5th

表面活性剂TighthydrationshellProteincoreLoosehydrationshell洗脱方法?3)、洗脱方法降低离子强度增加|pH–pI|[乙二醇]or[I-][表面活性剂]2．疏水性相互作用层析的操作吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与其他类型的柱层析法相同。为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上，选择适当的缓冲液、pH和离子强度，也要考虑温度因素。为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子，可以用下列的一种或几种方法：①改换一种具有较低盐析效应的离子；②降低离子强度；③增加洗脱剂的极性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性剂的洗脱剂每次实验结束后，吸附剂需要再生。因为吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、表面活性剂等。未经再生的疏水吸附剂，其吸附容量将明显降低。一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附剂。吸附剂经再生后可反复使用。蛋白质的纯化过程中，各种分离技术结合的顺序是很重要的。疏水层析可用在沉淀步骤之后，或与凝胶过滤、离子交换层析结合使用。

二、疏水性相互作用层析的应用及特点1st互补工具：HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相当。2nd与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3rd可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。4th疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。五反相层析反相层析(Reversed—phasechromatography，RPC)是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。与前述HIC同样，RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性。因此，必须采用极性有机溶剂（如甲醇、乙氰等）或其水溶液进行溶质的洗脱分离。

RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。

溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。

例如，烃类化合物的分配系数与其分子所含碳原子数成正比。与其它层析法一样，当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此RPC多采用降低流动相极性(