基因工程知识点总结归纳

基因工程绪论1、克隆clon：作名词：含有目的基因的重组DNA性生殖。作动词：基因的分别和重组的过程。2基因工程〔geneengineerin：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。3、基因工程诞生的根底的双螺旋构造和半保存复制机理；60年月确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。三大技术根底：限制性内切酶的觉察；DNA连接酶的觉察；载体的觉察DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶〔restrictionenzyme是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。2、限制酶的命名：属名〔斜体〕+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均一样的限制酶。5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生一样的黏性末端的酶形成的位点不能被原来的酶识别。6、限制性内切酶的活性：在适当反响条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。7、星号活性：转变反响条件，导致限制酶的专一性和酶活力的转变。8、DNADNA分子或闭合单9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。链的合成。11、DNA聚合酶：5’—3’聚合：除去3’端突起。补齐5’端突起。合成cDNA其次链。切口移位探针的制备。用途:用同位素标记具5’端突起的DNA5’粘性末端。DNA序列测定。合成cDNA其次链。要用于PCR。12、主要修饰酶：碱性磷酸酶：除去核酸分子3’和5’端的磷酸基团。T多聚核苷酸磷酸激酶：催化AT中的γ位的磷酸基转移5-OH(3)末端脱氧核苷酸转移酶：在3’端高效添加脱氧核苷酸。分子克隆载体DNA片段插入并携带重组分子进入宿主细胞进展扩增或表达的DNA分子。2、分子克隆载体的功能：为外源基因供给进入受体细胞的转移力量为外源基因供给在受体细胞中复制或整合的力量3、载体的分类：按用途分：克隆载体、表达载体、整合载体λM13cosmid载体、phagemid载体；真核病毒载体4、载体的特点：至少有一个复制起点，因而至少可在一个生物体中自主复制至少有一个克隆位点，可供外源DNA插入至少有一个标记基因，以学问载体或重组DNA分子是否进入受体细胞具有较小的分子量和较高的拷贝数入宿主细胞6、标记基因的种类：抗性标记基因；养分标记基因；生化标记基因；噬菌斑7、常用的遗传标记基因：四环素抗性基因〔T；氨苄青霉素抗性基因〔Ap；Cm〔Kan〔Neo〔葡萄糖苷酸酶基因〔Gu；荧光素酶基因；发光蛋白质基因。8、按复制起点划分克隆载体：质粒复制型—复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体〔有低拷贝和高拷贝〕ARS复制型—染色体复制型〔一般拷贝数比较高〕RNA必需反转录为cDNA〔高拷贝〕混合复制型：不同种生物复制起点混合〔穿梭载体〕9、依据载体的分子生物学特性划分：质粒载体、病毒型载体、混合型载体10、依据载体功能分类：1〕一般型载体：至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因。如PBR322和pUC载体2〕3类：Ⅰ型：转录起始区〔调控序列+启动子〕+终止子；Ⅱ型：转录起始区+翻译起始区〔核糖体结合序列和起始密码子〕+终止子；Ⅲ型:转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+〔常称之为表达分泌型载体〕失控型质粒载体(Run-awayplasmidvector)：是一些低拷贝质粒，其复制显著变化。探针型载体：该类载体主要特点是含有一些特别的DNA序列，用于特定的争论目的，如分别基因启动子、终止子、DNA复制起点等。定序型载体：主要用于核苷酸的序列测定整合型载体：主要用于基因治疗，稳定表达外源基因。9、标记基因与拷贝的关系：假设标记基因的表达效率较高，宿主细胞可能不大量基因，可降低该基因的表达效率。大肠杆菌分子克隆载体1、E.coli隆载体的种类质粒载体—复制起点来自一些自然质粒。噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段，以利于体外包装噬粒载体〔phagemid〕—有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。2、质粒的特点：质粒DNA的复制与染色体复制无关质粒DNA以超螺旋形式存在质粒DNA可以结合转移质粒的不相容性和不相容群质粒DNA的消退质粒的整合3、大肠杆菌质粒的复制：以RNAⅡ为引物合成，RNAⅠ与RNAⅡ结合可削减质RNAⅠ复制起点上游一个核苷酸处G突变为T，使得拷贝数增多。4互干扰造成。：线性双链DNA病毒，具有末端互补的12个核苷酸，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48.5kb。6、热诱导表达：λclts857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在λclts8574230℃不表达。7、λ噬菌体载体的缺点：基因组太大；酶切点太多；野生型只能接纳肯定长度的DNA。8、λ噬菌体载体的改造：切去非必需片段，加载目的基因增加标记基因、COSλ的cos位点片段，双cos载体比单cos载体易于重组。10、COSDNA分子可进展体外包装，并能感染大肠杆菌细胞；操作简洁，易于转化细胞；对重组DNA分子长度具有选择性包装。1〔phagemidM13或fd方向打算在噬菌体颗粒中形成正链还是负链。基因操作的主要技术原理1、核酸分别提取的原则：保证核算的一级构造的完整性；排解其他分子的污染2、质粒载体分别的关键：如何使质粒与DNA与宿主染色体DNA分开DNA比染色体DNADNA体断裂成片段，而质粒DNA仍保持超螺旋构型3、变性法提取质粒DNA的原理：在变性条件〔碱性或高温)下，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。当变性条件恢复时，质粒DNA快速复性恢复自然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状构造，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。4、RNA分别纯化的关键：防止内外源RNase的作用的特点：抗酸抗碱；抗高温严寒；抗变性剂，酶活性不需要关心因子，剂等。6、核酸的浓缩：沉淀法：可以除去溶液中某些可溶的盐离子和杂质。7、核酸凝胶电泳的根本原理：核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向量小的DNA，具有较严密的构型，在凝胶中移动快；反之，分子量大的DNA移动慢。8、核酸凝胶电泳常使用溴酚蓝作为指示剂、溴化乙锭作为染色剂9、脉冲场凝胶电泳原理：加在凝胶上至少有两个电场方向，使得DNA分子要不DNA分子用于转变泳动方向的时间不同，则可以得到分别10、双脱氧核苷酸终止法的原理：双脱氧〔2”，3”〕2”脱氧核苷酸那样直接掺入合成的A3OA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNADNA片段测定出核苷酸序列每个体系中参加dNTP和一种双脱氧核苷酸，DNA聚合酶定序反响，反响产物变性后电泳，凝胶枯燥，放射自显影，依据条带读出碱基序列，再依据碱基互补配对原则写出DNA链的序列〔留意：要自己写一个序列，然后写上每个体系中消灭片段的序列，然后依据序列画出电泳图，考试考的可能性大，书上有步骤〕12、MaxamGilbert化学法原理：DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反响在碱性环境下硫酸二甲酯能使碱基GAGC和TC生1~2DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列13、化学法测序的优点、不需要模板、引物和DNA聚合酶。1Southern杂交SouthernblotDNA在原位变性，并从待测样品中是否存在互补的核酸序列Southern杂交的一般步骤：DNA的制备→DNA酶切→电泳〔琼脂糖凝胶电泳〕→DNA原位转膜→探针杂交→放射自显影→结果分析15、Northern杂交检测的是RNA。步骤与southern类似，不需要酶切。16、Western蛋白质SDS中转移到一固检测。主要用于基因表达产物蛋白质的检测。→SDS-→电转移至膜上→一抗的制备→一抗与膜结合〔1h〕→洗膜〔30min〕→二抗与膜的结合→洗膜→显色反响→结果分析17、PCR反响体系：模板、引物、dNTP、buffer、taq酶、超纯水。、引物设计的一般原则：引物的长度常为17至30个碱基；GC含量为40%至60%；Tm值高于55；两条引物之间配对碱基数小于5；引物自身配对的碱基数小于3。基因文库的建立1、基因组文库：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。2、建立基因组文库的一般程序:载体DNA片段的制备：DNA分别，限制酶切割，脱磷酸化反响供体DNADNADNA片段。供体和载体DNA的连接:要留意混合的比率和浓度重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增基因组文库质量的评价：文库规模、重组频率3、利用λ载体构建基因组文库:载体DNA片段的制备的方法：左右臂DNA片段的获得供体DNA片段的制备：限制酶局部酶切，机械剪切法重组DNA分子的形成：掌握混合的比率重组DNA分子的包装：制备包装物，然后进展包装基因组文库的扩增4、为提高文库的质量，实行以下措施:双酶切载体产生不同末端以避开其自身形成串状体供体DNA脱磷酸化以避开供体DNA间的连接导致重排载体和供体DNA末端修饰以避开上述两种情形发生:载体补CT，供体补GA承受文库快速构建法以避开扩增文库时DNA丧失5、基因组文库的载体可载入DNA大小：1〕质粒最大15kb适合构建cDNA文库；亚克隆2〕噬菌体最大25kbcDNA文库3〕COS质粒30-45kb基因组文库4〕噬粒最大12kbcDNA文库5〕P170-90kb基因组文库6〕BAC100-500kb基因组文库7〕YAC250-1000kb基因组文库DNA有效的筛选程序从众多克隆中分别出含有目的基因的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分别。选含有目的基因的目的重组子。8、鸟枪法的改进:目的基因的酶切图谱；在连接前将DNA片段进展分级分别9、鸟枪法克隆基因的局限性：工作量较大，需要了解目的基因的背景学问不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结果、cDNAmRNA经反转录成cDNA后再重组和增值所产生的无性生殖系的总和。、cDNAcDNA均可获得表达12、建立cDNA文库的一般程序载体DNA片段的制备〔A〕RNA的分别制备双链cDNA的合成：反转录法合成单链cDNA，碱解或酶解除去RNA合成其次链ds-cDNA与载体DNA相连：人工接头、同聚物加尾、cDNA的定向插入染13、其次链合成的方法：自身引导法、置换合成法、引导合成法。前两者5’端会有几个碱基缺失。目的基因的分别和鉴定1、获得基因的一般方法：化学合成法:主要用于较小基因的合成或需要转变碱基半化学合成法：mRNA cDNA 加人工接头或合成一段DNA 与载体相连、筛选法：用各种方法从基因文库或cDNA文库中选择目的基因2、基因筛选的方法:1)遗传互补法原理：当一外源DNA片段引入一受体细胞后，假设受体细胞获得某转入外源DNA片段之后，涂布在合成培育基上可以生长；无某种表型的细胞会有性状；某些产酶细胞则可能过量产酶。酿酒酵母MFα基因的筛选：基因组文库DNA转化酿酒酵母细胞在缺乏亮氨酸的培育基上培育能生长的重组子即含合成亮氨酸的基因分别目的基因。分别步骤：基因(基因组或cDNA)文库→制备DNA样品膜→与标记探针杂交→DNA进一步证明和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级3〕免疫法原理:外源DNA引入宿主细胞后表达出蛋白质，以此蛋白质为抗原与相基因。分别步骤:基因文库→蛋白质样品膜制备→免疫法筛选→〔阳性克隆〕→进一步证明：分别阳性克隆无细胞抽提物，作斑点印迹，western印迹免疫分析；分别重组DNA，检测插入片段大小，测序等。染色体巡查法蛋白质-DNA杂交法蛋白质-蛋白质结合法，即酵母双杂交法原理：利用酿酒酵母的GAL4蛋白质NUAS〔上游激活序列〕报告基因表达筛选目的基因的方法。GAL4蛋白质基因是一个调控基因，掌握半乳糖利用酶类基因的表达，其5’端存在UAS。GAL端具有UAS-DNA结合域BC端具有转录激活构造域A，这两个构造域可以单独起作用。分别与两个基因编码序列融合，且两种蛋白质能相互作用，就可导致GAL-LacZ基因的表达。与BD融合的基因称为钓饵基因，与AD融合的基因称为目的基因。3、用于基因分别和鉴定的关心方法：抑制消减杂交法；差异杂交法；阻断翻译法；释放翻译杂交法植物基因工程1、植物组织培育技术：愈伤组织培育、细胞悬浮培育、原生质体、植株再生注射法3〔kaHyBa〔BtGuGF、启动子〔CaMA)4、Ti质粒有六个功能区：致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解Ti质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移毒性区r：直接参与的转移和插入植物染色体A复制区〔：参与i质粒A复制5、将致瘤区替换成目的基因即可取出冠瘿6、根瘤农杆菌转化的一般步骤：叶盘法：从植物叶片上用打孔器取假设干叶片→制备含有目的基因的Ti质粒→24小时→将叶片转移至筛选培育基上→诱导愈伤组织→诱导生根→移栽作物品种8、转基因植物的问题：转基因沉默：位置效应、转录水平的基因沉默、转录后水平的基因沉默。选择基因安全性问题；对生态环境的影响动物基因工程1、从遗传学角度划分：遗传性动物基因工程、非遗传性动物基因工程2、动物基因工程载体具备的功能：为外源基因供给进入受体细胞的转移力量为外源基因供给在受体细胞中复制或整合的力量为外源基因供给在受体细胞中扩增和表达的力量3、动物基因工程载体：质粒型载体、病毒型载体、定向打靶载体〔基因敲除、基因下调〕4、哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记：遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸G418APH灭活G418转移酶DHFR二氢叶酸复原氨甲喋呤DHFR突变体抗酶氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷氨基喋呤TK合成TMP激酶XGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤霉酚酸XGPRT 合成磷酸核糖转移GMP酶ADA-ADA-腺嘌呤核苷脱腺嘌呤木酮ADA灭活Xyl-A氨酶糖苷5、基因转移技术：物理转染法：电击法、显微注射法、基因枪法、超声波法化学转染法：磷酸钙法、脂质体法、原生质体法生物法：病毒感染法6、转基因动物制备