发酵液预处理

第二章

发酵液的预处理和固液分离1生物技术下游加工过程的一般步骤

2预处理和固液分离内容固液分离发酵液胞外上清液/滤液预处理提取生化物质的第一步，分两部分：胞内富集细胞3发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代谢产物，及剩余的培养基残分等。不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首先要进行培养液的预处理和固液分离开，才能进行后续操作：对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去除，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。对于胞外产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分离，然后提取胞内产物。42.1发酵液的预处理（Pretreatment）5为何要对发酵液进行预处理？发酵液的基本特性发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似。可压缩性液相粘度大，大多为非牛顿型流体；悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动6为何要对发酵液进行预处理？固液分离方法主要是过滤和离心。对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大，设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生膜污染，通量降低。发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在也会影响固液分离。因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离速度显得十分必要。预处理是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤7预处理的目的促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子、杂蛋白质、及色素、热原质、毒性物质等有机物质），以利于后续各步操作。⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；

8预处理的方法凝聚和絮凝Coagulationandflocculation

加热法Heating调节悬浮液的pH值RegulationofpH杂蛋白的去处Removalofuselessprotein高价无机离子的去处Removalofinorganicion助滤剂Filteraids和反应剂Reactant

9一凝聚和絮凝在发酵液预处理中的应用凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大体积以便固液分离。凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。10凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１mm大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。凝聚和絮凝11凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）

机理：

1）中和粒子表面电荷

2）消除双电层结构3）破坏水化膜

（一）凝聚Coagulation12发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。胶体双电层结构13两种相反作用力下，双电层分裂成两部：1）吸附层或stern层；2）扩散层。形成了扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Sternmodel)。胶体双电层结构14吸附层：距胶核表面约一个离子半径的Stern平面以内，正离子被紧密结合在胶核表面，不流动。分散层：紧密层外围反离子浓度逐渐降低直至达到主体溶液的平均浓度。滑移面：当胶体粒子在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体，随着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大。15胶体双电层结构不同界面上形成不同的电位:胶核表面的电位φs是整个双电层的电位;Stern平面上的电位为φd;滑移面上的电位为ζ,称ζ电位（电动电位）。图2-116ζ电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征，并作为研究凝聚机理的重要参数。带电粒子间的静电相互作用取决于ζ电位的大小。当双电层的ζ电位足够大时，静电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用，使蛋白质溶液处于稳定状态。17ζ电位的计算：D—水的介电常数；q—胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷密度；

δ—扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩散层界面处电位φd降低到其值为1/e处的距离，不能直接测定.式2-118δ—扩散层的有效厚度式中N—阿伏伽德罗常数；T—热力学温度：k—波尔兹曼常数；e—电子电荷；Zi—i种反离子的化合价；Ci—i种离子的摩尔浓度。式2-219双电层与凝聚由式（2－1）和式（2－2）可知，ζ电位与扩散层厚度δ和电动电荷密度q成正比，而扩散层厚度又与溶液中反离子强度和电荷成反比。对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层的厚度，促使ζ电位迅速降低，而且化合价越高，这种影响越显著。20凝聚价或凝聚值在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能脱除胶粒表面的水化膜，降低ζ电位，使双电层的排斥力减少，当不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔／升），称为凝聚价或凝聚值。21Schulze－Hardy法则：反离子的价数越高，凝聚价越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力受化合价、水化半径、离子运动能力的影响，次序为Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+22常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；氯化铝AlCl3•6H2O;三氯化铁FeCl3;硫酸亚铁FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO323絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程

机理：架桥作用

采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。（二）絮凝flocculation24絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括离子基团以及非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生架桥联结时，就形成较大絮团，产生絮凝作用。

絮凝25高分子絮凝剂的吸附架桥作用26可分为四类：人工合成有机高分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物、微生物絮凝剂1）目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物。工业上使用的絮凝剂27高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：阴离子型（含有羧基)、阳离子型（含有胺基）、非离子型28聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂292）天然有机高分子絮凝剂人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快，但还存在着残留单体有毒，生物降解难等问题，所以其应用受到了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物降解，原料来源广等优点。天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。303）无机高分子聚合物有聚合铁系和铝系两大类铁系絮凝剂具有操作简单、费用低，受温度影响小，亲和力强，能有效地去除悬浮物、表面活性剂、破坏油水乳状液的能力很强等优点，缺点腐蚀性强、稳定性差。铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机金属盐絮凝剂，絮凝效果好，缺点具毒性等。31微生物絮凝剂微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，一类由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能的代谢产物。包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。32微生物絮凝剂1、微生物絮凝剂的商业化生产始于20世纪90年代，如红平红球菌及由此制成的NOC-1是目前发现的最佳微生物絮凝剂

2、微生物絮凝剂或将大部分替代普通絮凝剂3、浮游藻类、草分枝杆茵、硅酸盐芽孢杆菌。33絮凝的影响因素发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖；絮凝剂的分子量；pH控制；搅拌速度。34

a.絮凝剂浓度

浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量会引起吸附饱和，在胶粒上形成覆盖层而产生再次稳定现象。最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖；35

分子量提高、链增长，可使架桥效果明显；但分子量不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分子絮凝剂的水溶性降低，因此，分子量的选择应适当。b.高分子絮凝剂分子量36

溶液pH的变化会影响絮凝剂功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，链节上相邻离子基团间的电排斥作用，使分子链从卷曲状态变为伸展状态，架桥能力提高。c.溶液pH37对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好絮凝效果；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。（三）混凝38二预处理-加热1）加热降低液体粘度流体力学原理：过滤速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。液体黏度是温度的指数函数，升温是降低黏度的有效措施。加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。加热能改善发酵液的操作特性。麦芽汁的黏度-温度曲线。39二预处理-加热2）加热使蛋白质变性凝固变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加热至80℃以上，可使蛋白质变性凝固，过滤速度加快。加热处理只适用于对热较稳定的液体。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。有时加热会增加发酵液的颜色增加后处理的难度。

40三预处理-调节pHpH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质，可减少膜堵塞和污染；影响离子型絮凝剂的电离度。41

0020040060061218pH4.6pH4.2pH3.8pH2.8FiltrateVolume,cm3Time,minutesFigTheeffectonfiltratevolumeofpH42

案例

链霉素生产中，采用调pH至酸性pH3.0，加热至70℃，维持半个小时的方法来使蛋白变性，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。43四

加入惰性助滤剂（filteraids）

助滤剂是一种颗粒均匀，质地坚硬，不可压缩的粒状惰性物质。在发酵液中加入固体助滤剂，则菌体可吸附于助滤剂微粒上，助滤剂就作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。目前生物工业中常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白土等。44助滤剂的选择(1)粒度根据悬浮液中的颗粒和滤液的澄清度确定，一般颗粒较小的滤饼应采用细小的助滤剂。(2)助滤剂的品种应根据过滤介质选择助滤剂品种。使用粗目滤网时易泄漏，可选择石棉粉、纤维素；采用细目滤布时，可使用细硅藻土；(3)用量间歇操作时，过滤介质表面预涂助滤剂，其厚度应不小于2mm。连续过滤机中根据过滤速度确定。使用硅藻土时，通常细粒为500g/m3，中等粒度700g/m3,粗粒700-1000g/m3。45五.加入反应剂加入某些不影响目标产物的反应剂，可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速度。

1）加入反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，又能使蛋白质凝固，过滤性能上升，沉淀本身可作为助滤剂.如在新生霉素发酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。2）发酵液中含有不溶性多糖物质时，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。46发酵液中的杂质高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）杂蛋白常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。六、发酵液的相对纯化

在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。47（一）高价无机离子的去除方法Ca2+——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）

；Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；Fe2+——黄血盐，→普鲁士兰沉淀48（二）杂蛋白的去除方法沉淀法precipitation变性法Denaturation吸附法adsorption491.杂蛋白去除-沉淀法precipitationA等电点沉淀法（isoelectricprecipitation）蛋白质的等电点大都在酸性范围内(p