仪器分析高效液相色谱法1课件

高效液相色谱法

highperformanceliquidchromatography

1以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，发展而成的分离分析方法。以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实现在线检测和仪器化。具有分离效能高、分析速度快、应用范围广等的优点。第一节

概述

2与气相色谱法对比GC快速、分离效率高、样品用量少。在约300万个有机化合物中，可以直接用该法分析的占20%。HPLC快速、分离效率高、样品不受挥发性及热稳定性的约束，因而分析对象广。3第一节高效液相色谱法的主要类型和原理LLC和LSC分配、吸附、离子交换和空间排阻化学健合相色谱法ISC和PIC/IPC5二、化学键合相色谱法将固定液的官能团键合在载体的表面构成化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为键合相色谱法。键合相色谱法是应用最广的色谱法。6键合相色谱法正相色谱法反相色谱法RHPLCISCPICorIPC7（二）反相键合相色谱法常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS）

常用流动相：甲醇—水，乙腈—水分析对象：非极性、中等极性的分子型化合物分离机制：疏溶剂理论认为在该法中溶质的保留是溶质分子与极性分子间的排斥力。9反相键合相色谱法影响保留行为的因素溶质的分子结构

极性，疏水性，k，tR

流动相

与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量，k流动相的pH影响溶质的离解程度，离解程度，k固定相

随碳链延长，键合相疏水性，k碳链一定时，键合相浓度，k10离子抑制色谱法ISCISC—调节RLLC流动相pH值以抑制组分的离解

抑制剂：弱酸(HAc)、弱碱(NH3H2O)或缓冲液

分离机制：调节流动相pH，抑制组分的理解，以中性分子的形式在固定相和流动相之间产生分配平衡。

分析对象：3.0≤pKa≤

7.0的弱酸7.0≤

pKa≤

7.0的弱碱

两性化合物

11（三）反相离子对色谱法RPIC—在一般RLLC流动相中加入离子对试剂。

常用的离子对试剂：分析碱用烷基磺酸盐，分析酸用四丁基季胺盐。

分离机制：离子对试剂与被分析的离子形成中性离子对，在固定相和流动相之间产生分配平衡。分析对象：各类有机酸、碱、盐及两性化合物

13保留机制-离子对模型B+HBH+RSO3NaRSO3-+Na++BH+RSO3-固定相BH+RSO3-14影响容量因子的因素离子对试剂的种类和浓度

分析酸性类物质季铵盐分析碱性类物质烷基磺酸盐或硫酸盐PIC试剂碳链，k在低于胶束浓度时，PIC试剂浓度，k流动相的pH影响PIC试剂和组分的离子化15三、其他高效液相色谱法离子色谱法（ionchromatography）手性色谱法（chialchromatography）亲和色谱法（affinitychromatography）17离子色谱法（ionchromatography）离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法抑制型（双柱型）和非抑制型（单柱型）分离柱交换反应：R＋－OH－+NaX→R＋－X－+NaOH洗脱反应：R＋―X－+NaOH→R＋－OH－+NaX抑制柱与组分反应：R――H＋+NaX→R――Na＋+HX与洗脱剂反应：R－―H＋+NaOH→R――Na＋+H2O18第二节HPLC的固定相和流动相及其选择固定相应满足下列要求颗粒细、均匀传质快机械强度高，耐高压化学稳定性好，与流动相不发生反应19（一）键合相的种类

1.非极性键合相表面基团-C18H37-C8H17OHSiOSiOHOSiOHOSiOSiOHOH硅胶表面212.弱极性、极性键合相弱极性键合相：

O正相和反相均可极性键合相：

CNNH2

一般作正相OSiCH3CNCH3(CH)2nSi22（二）键合相的性质和特点键合反应含碳量和覆盖度键合基团的链长增加，极性降低，载样量增大，容量因子增加。键合相的特点

不流失、稳定、载样量大注意点pH适用范围23流动相对分离的影响

分离度R与n、、k2的关系n-决定于色谱柱（固定相）性能。、k-受溶剂系统（流动相）影响。

R=n4-1k2k2-1(a)(b)(c)25AB23AB12AB12增加246810110070030010060%乙腈Time(min.)mAU40%水溶剂洗脱强度增加20001600600080%乙腈Time(min.)mAU100020%水246810InjectTime高柱效低柱效柱效增加26在HPLC中纵向扩散项B=2Dm

Dm

T/B/u减小至忽略不计涡流扩散项A=2dp降低降低dp

传质阻力系数CCm+CsmH=A+Cu=A+Cmu+Csmu

近似认为流动相的流速与板高成直线关系，流速增大，板高增加，柱效降低。一般采用1ml/min。29固定相粒度对板高的影响

Cm=dp2/Dmdp—固定相微粒直径小粒度、均匀的球形化学键合相低粘度流动相，流速不宜太快柱温适当30（二）正相键合相色谱法的分离条件固定性极性>流动相极性固定相：极性键合相

流动相：烷烃（底剂）+极性调节剂

正相洗脱时，依靠组分的极性差别而分离出峰顺序：极性小的组分先出峰。31（三）反相键合相色谱法的分离条件流动相极性>固定相极性固定相：非极性键合相

流动相：甲醇-水、乙腈-水，常加入弱酸、弱碱或缓冲盐调节流动相pH以抑制组分离解，增加保留

反相洗脱时，出峰顺序：极性大的组分先出峰。

32（四）反相离子对色谱法的分离条件离子对试剂的选择流动相pH的选择有机溶剂及其浓度的选择33四、其他固定相键合型离子交换剂手性固定相分析、分离对映体的最重要手段。制备单一构型的活性异构体是世界制药业的大方向。亲和色谱固定相虽然并非新方法，但近年来有了长足的发展。利用亲合反应的专属性