第二十章常用分子生物学技术的原理及其应用

生物化学与分子生物学张金玉常用分子生物学技术的原理及应用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第二十章常用分子生物学技术的原理及应用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridizationandBlottingTechnique核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理复性RNADNA（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到硝酸纤维素(NC)等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。目前这种技术已广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测。常用的固相支持物硝酸纤维素膜、尼龙膜、化学活化膜。转膜的方法1、毛细管虹吸法：利用高盐转移缓冲液的推动作用和虹吸作用。虽转移率不高，但应用广泛。2、电转印法：利用电泳作用将凝胶中的DNA转移到膜上。适用于转移大片段DNA。3、真空转移：原理同毛细管虹吸，需真空泵。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术探针的种类人工合成的寡核苷酸片段、基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段。探针的标记物1、核素标记物：（放射性同位素）灵敏度高，特异性强，常用32P，35S，3H，125I，14C。易造成放射性污染，同位素半衰期短，必须随用随标。2、非核素标记物：灵敏度低，特异性差，但无放射性污染，探针标记后可长期保存（2年以上）。常用生物素、地高辛、辣根过氧化物酶（HRP）、荧光素（FITC、罗丹明类）、化学发光剂。二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹

(Southernblotting)（二）RNA印迹(Northernblotting)（三）蛋白质的印迹

(Westernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。（一）DNA印迹

(Southernblotting)1、制备待测DNA，DNA的限制性内切酶消化；2、待测DNA样品的琼脂糖凝胶电泳分离；3、凝胶中核酸的原位变性；4、转膜；5、杂交；6、洗膜；7、杂交结果的检测-放射自显影。用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。ＤＮＡ印迹①②③放射自显影照片SouthernblottingSouthernblotting（二）RNA印迹(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析其技术原理与Southernblotting相同。RNA分子较小，转移前无需限制酶切割；在变性剂存在下（防止形成发夹结构）直接进行琼脂糖凝胶电泳；电泳结束后，不需要再进行变性和中和，直接转膜，转移效率也比较高。尽管RNA印迹技术检测mRNA表达水平的敏感性较PCR法低，但其特异性强，假阳性率低，仍然被认为是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一。（三）蛋白质的印迹

(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究1、混合蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；2、将蛋白质转移到NC膜或其他膜上（电转移）；3、第一抗体首先与转移膜上相应的蛋白质分子结合；4、第二抗体（放射性核素或碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记）与之结合；5、放射自显影或底物显色来检测蛋白质区带的信号。三种印迹技术的比较斑点印迹(dotblotting)不经电泳分离直接将样品点在ＮＣ膜上用于杂交分析原位杂交(insituhybridization)

组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析DNA芯片技术(DNAchip)

将多种已知序列的ＤＮＡ排列在一定大小的尼龙膜或其他支持物上用于检测细胞或组织样品中的核酸种类。其他：DNA芯片技术第二节PCR技术的原理与应用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnologyPCR（polymerasechainreaction)中文全称为聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。PCR技术是1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。

PCR具有敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。

KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。一、PCR技术的工作原理

用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。

以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5'末端和3'末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR的基本反应步骤1.变性(Denaturation)：

加热到94℃使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。2.退火(复性)(Annealling):

将温度下降至适宜温度（较Tm低5℃-55℃

），模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。PCR的基本反应步骤3.延伸(Extension):将反应温度升至酶的最适温度72℃

，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，以引物的3'端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。

上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

PCR的基本反应步骤变性94˚C延伸72˚C退火55˚C5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55目录PCR技术的工作原理Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录PCR技术原理示意图

PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5'端之间的DNA片段。

模板DNA

PCR技术对模板质和量的要求并不十分严格。一般来说宜用ng量的克隆DNA，μg水平的染色体DNA作起始材料。

特异性引物预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。

耐热DNA聚合酶（耐热TaqDNA聚合酶）

dNTPs

Mg2+

缓冲液水

PCR反应体系的基本组成成分利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因的体外突变将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术RT-PCR示意图原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术实时PCR(real-timePCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。定量PCR技术实现了mRNA和miRNA水平的快速、准确的定量分析，已经在基因诊断方面得到临床应用。实时PCR技术原理实时PCR的基本原理是引入了荧光标记分子，并使荧光信号强度与PCR产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，即可计算出PCR产物量。也称为实时荧光定量PCR或荧光定量PCR。实时PCR分类实时PCR非探针类：加入了能与双链DNA结合的荧光染料，

SYBRGreen-DNA小沟，荧光信号强度与结合双链DNA量成正比，可实时监测PCR产物量的多少-大量应用探针类1.TaqMan探针法2.分子信标探针法3.荧光共振能量转移(FRET)探针法1、TaqMan探针法5’-荧光报告基团-R3’-荧光淬灭基团-QTaqMan探针：TaqMan探针能与模板DNA特异性结合。没有扩增反应时，探针保持完整，R和Q同时存在于探针上，无荧光信号释放；随着PCR进行，聚合酶在链上延伸遇到荧光探针，其5’→3’核酸外切酶活性将探针逐步切断，R与Q分离，产生荧光信号，被荧光检测系统接收，用于数据分析。TaqMan探针法实时PCR技术原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物荧光标记引物RQ3'3'5'5'TaqMan探针法实时PCR原理示意图2、分子信标探针法与TaqMan探针法相似，也标记有R和Q基团，但不同的是分子信标探针是一种呈发夹结构的茎环寡核苷酸探针，即其两端的核苷酸序列互补配对。探针未与靶序列杂交时形成发夹状态R与Q靠近，荧光几乎完全淬灭；杂交后，发夹展开，R与Q分开，荧光得以恢复，荧光检测系统即可接收到荧光信号。3、FRET探针法：双杂交探针或LightCycle探针

有两条能与模板互补、且相邻的特异探针组成（1～5bp），上游探针的3’端标记荧光供体基团，下游探针的5’端标记Red640荧光受体基团。复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和受体基团紧密相邻，激发供体产生荧光能量被受体基团吸收（发生FRET），可检测到Red640发出的荧光；变性时，两探针游离，两荧光基团距离远，不能检测到Red640的荧光。

FRET探针法探测的是实时信号，是可逆的，在突变分析、SNP基因分型等方面更具有优势。第三节基因文库GeneLibrary基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。基因组DNA文库的构建和筛选分离纯化细胞基因组DNA；限制性内切酶消化基因组DNA，获得一定大小的DNA片段（20Kb左右）；选择载体（噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等）；将基因组DNA片段连接入载体；将重组载体转入宿主菌可获得扩增；用探针进行杂交，筛选阳性克隆，获得目的基因。基因组DNA文库和cDNA文库的构建和筛选第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、cDNA文库

cDNA文库的构建和筛选提纯组织细胞mRNA；mRNA逆转录合成cDNA；选择载体（质粒或噬菌体）；将cDNA连接入载体；将重组载体转入宿主菌可获得扩增；用探针进行杂交，筛选阳性克隆，获得目的基因。基因组DNA文库和cDNA文库的构建和筛选

cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对

真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从

cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。第四节生物芯片技术BiologicalChipTechnique一、基因芯片基因芯片(genechip)是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。基因芯片可在同一时间内分析大量的基因，实现了基因信息的大规模检测。基因芯片特别适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的基因差异表达情况。一、基因芯片基因芯片(genechip)

基因芯片的原理：双色荧光探针杂交将两个不同来源样品的mRNA逆转录合成cDNA时用不同的荧光分子（正常用红色，肿瘤用绿色）进行标记，标记的cDNA等量混合后与基因芯片进行杂交，在两组不同的激发光下检测，获得两个不同样品在芯片上的全部杂交信号。绿色荧光-该基因只在肿瘤组织表达；红色荧光-正常组织表达；黄色-两种组织均表达。双色荧光标记探针基因芯片工作流程示意图二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应：抗原-抗体或受体-配体最常用的探针蛋白是抗体。蛋白质芯片(proteinchip)蛋白质芯片作用原理是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。样品标记法蛋白质芯片工作流程示意图第五节生物大分子相互作用研究技术

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